順氣化痰方對慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的影響

郭　媛，耿立梅

(1. 石家莊大德中醫(yī)門診部，河北 石家莊 050000；2. 河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)以不完全可逆性及持續(xù)進(jìn)展性氣流受限為特征。目前認(rèn)為COPD的發(fā)病機(jī)制主要為炎性因子相關(guān)機(jī)制[1]，氣道黏膜發(fā)生炎性反應(yīng)，釋放炎性遞質(zhì)，氣道黏膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致氣道的反復(fù)損傷和修復(fù)[2]。順氣化痰方為臨床治療COPD的有效方劑，本實驗旨在進(jìn)一步探討該方的治療機(jī)制。

1　實驗資料

1.1實驗動物Wistar清潔雄性大鼠32只，體質(zhì)量240～260 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2實驗試劑脂多糖(LPS，美國Sigma公司，批號：L2880-10，10 mg/瓶)；戊巴比妥鈉(上海陽光生物技術(shù)有限公司)；新石家莊牌香煙(石家莊卷煙廠，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.0 mg，煙氣一氧化碳量13 mg)；生理鹽水(石家莊四藥)；中性樹脂(上?；瘜W(xué)試劑公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)放射免疫分析藥盒(北京華埠力特生物技術(shù)研究所)；白細(xì)胞介素-8(IL-8)放射免疫分析藥盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司)。

1.3實驗儀器自制熏煙箱(80 cm×60 cm×50 cm有機(jī)玻璃箱)；導(dǎo)煙裝置(Longer-Pump)；大鼠解剖臺(張家港市青松生物醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；IX-70倒置相差顯微鏡(日本Olympus)；FJ-2021型γ-放射免疫計數(shù)器(西安二六二廠)；756MC型紫外-可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；PE9600型PCR擴(kuò)增儀(美國PE公司)；紫外透射儀(北京鼎國)，數(shù)碼顯微鏡 DP73(日本Olympus)；電冰箱(BCD 青島海爾)；石蠟包埋機(jī)(德國LEICA公司)。

1.4實驗藥物順氣化痰方，由蜜麻黃、杏仁、石膏、白前、前胡、浙貝母、紫菀、冬花、炙杷葉、甘草組成。大鼠用藥量按成人日服量換算，依據(jù)大鼠與人體表面積計算給藥量。

1.5動物分組及處理雄性Wistar大鼠于實驗室給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水1周后，隨機(jī)將大鼠分為正常組、模型組、順氣化痰方高劑量組、順氣化痰方低劑量組，每組8只。除正常組外，其余組大鼠參照文獻(xiàn)[3]中煙熏聯(lián)合氣道滴入LPS法制備COPD模型。造模第1天和第14天，各造模組氣管內(nèi)滴入濃度為1 g/L的LPS 200 μL，正常組氣管內(nèi)滴入生理鹽水200 μL。第2—13天和第15—30天，將造模組大鼠放入自制熏煙箱內(nèi)，經(jīng)導(dǎo)煙裝置按每次15只香煙，每次20 min，間隔4 h，每日2次熏煙，每次熏煙濃度在5%左右。造模結(jié)束后，順氣化痰方高、低劑量組分別灌胃順氣化痰方13.5 g/kg、0.9 g/kg，正常組、模型組灌胃純凈水，均1次/d,連續(xù)30 d。

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1血清IL-8、TNF-α水平灌胃結(jié)束后第2天，10%水合氯醛麻醉大鼠，股動脈取血5 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，分離血清，應(yīng)用γ-放射免疫計數(shù)器測定各組大鼠血清IL-8、TNF-α水平。

1.6.2肺組織形態(tài)學(xué)處死各組大鼠后，切取右下肺組織，放于4%甲醛溶液內(nèi)固定24 h，石蠟包埋，切片HE染色，數(shù)碼顯微鏡下拍照，觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6.3MMP-2、MMP-8mRNA表達(dá)情況

1.6.3.1總RNA的提取取少許溶解的RNA，用TE Buffer稀釋后于紫外分光光度計260 nm和280 nm處讀取A值，總RNA濃度= A260×稀釋倍數(shù)×0.04 μg/μL，用前調(diào)整為1 μg/μL。

1.6.3.2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取總RNA 2 μg，加入RT反應(yīng)體系(含AMV Buffer，dNTPs，Oligo dT Primer，AMV，Rnase Inhibitor等)管中，于PCR儀42 ℃ 30 min(cDNA合成)，99 ℃ 5 min( 逆轉(zhuǎn)錄酶失活)，5 ℃ 5 min。 -20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃變性3 min;94 ℃變性40 s，退火50 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。RT-PCR反應(yīng)引物：MMP-2上游引物序列為5’-ACGATGATGACCGGAAGTGG-3’，下游為5’-GTGC TGGCAGAA TAGACCCA-3’；MMP-8上游引物序列為5’-TCCAGGTTACCCCACTAGCA-3’，下游為5’-TGCAACTCTAGTGACTCTGCG-3’;GAPDH上游引物序列為5’-GCAACTCCCATTCTTCCACC-3’，下游為5’-TGGTATTCGAGAGAAGGGAGGG-3’。

2　結(jié)　　果

2.14組血清IL-8、TNF-α水平比較模型組血清IL-8、TNF-α水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；順氣化痰方高、低劑量組血清IL-8、TNF-α水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且高劑量組明顯低于低劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1　4組血清IL-8、TNF-α水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與順氣化痰方高劑量組比較，P<0.05。

2.24組肺組織病理學(xué)表現(xiàn)正常組大鼠肺組織無明顯炎性細(xì)胞浸潤，支氣管黏膜無增厚，支氣管上皮纖毛排列整齊無脫落，肺泡壁無變薄破裂，未見肺大泡形成(見圖1)。模型組大鼠肺組織可見慢性炎癥細(xì)胞浸潤，主要為巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，可見支氣管壁增厚，纖毛脫落，氣道內(nèi)可見黏液栓形成及慢性炎細(xì)胞肺浸潤，可見肺泡壁破裂形成肺大泡，血管壁亦可見增厚，主要為小葉中心型肺氣腫改變(見圖2)。順氣化痰方高、低劑量組較模型組炎細(xì)胞浸潤程度輕，肺氣腫小葉破壞較少，且高劑量組較低劑量組輕(見圖3及圖4)。

圖1　正常組肺組織病理改變(HE×200)

圖2　模型組肺組織病理改變(HE×200)

2.34組大鼠肺組織中MMP-2、 MMP-8mRNA表達(dá)情況模型組MMP-2、 MMP-8 mRNA表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05)；順氣化痰方高、低劑量組MMP-2、 MMP-8 mRNA表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且高劑量組明顯低于低劑量組(P均<0.05)。見表2。

圖3　順氣化痰方高劑量組肺組織病理改變(HE×200)

圖4　順氣化痰方低劑量組肺組織病理改變(HE×200)

表2　4組大鼠肺組織中MMP-2、 MMP-8mRNA表達(dá)情況

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與順氣化痰方高劑量組比較，P<0.05。

3　討　　論

關(guān)于COPD的發(fā)病機(jī)制學(xué)說，目前主要有慢性氣道和肺部炎癥形成、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及氧化劑/抗氧化劑失衡等。吸煙是引起氣道慢性炎癥和氣道重塑發(fā)生發(fā)展的主要因素[4]，多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子參與COPD炎癥的形成[5]，導(dǎo)致氣道壁受損和肺氣腫發(fā)生，其中IL-8和TNF-α最具代表性[6]。IL-8是中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞強(qiáng)效趨化因子及化學(xué)激活劑[7]，在COPD氣道炎癥中起著直接的介導(dǎo)作用，可引起中性粒細(xì)胞向呼吸道遷移、活化，其水平升高可能是COPD病情遷延不愈的重要原因[8]。TNF-α可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)并分泌IL-8，同時促進(jìn)激活的中性粒細(xì)胞分泌IL-8、TNF-α，在COPD氣道炎癥的持續(xù)和放大中起到重要作用[9]。MMP在肺氣腫、肺泡壁細(xì)胞外質(zhì)破壞中起著重要作用。MMP是由中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞所產(chǎn)生，MMP增多使氣道結(jié)構(gòu)組織失去支撐作用，而且還促進(jìn)炎性細(xì)胞趨化、遷移、聚集及釋放炎癥因子和生長因子等，參與氣道壁的炎癥反應(yīng)[10]。MMP-2、MMP-8分別屬于明膠酶和膠原酶，MMP-2具有降解肺組織彈力纖維的作用，參與氣道重塑，在肺氣腫的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[11-12]。研究顯示，肺組織中MMP-2表達(dá)越高，COPD患者肺功能下降越嚴(yán)重，氣道阻塞越明顯[13]。MMP-8在COPD患者的痰液、支氣管肺泡灌洗液和肺組織中表達(dá)[14]，與支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞數(shù)目成正相關(guān)[15]。

中醫(yī)認(rèn)為COPD患者多有痰濁阻肺，邪留肺絡(luò)，宿根積久，肺氣升降失常，而氣逆多為痰，故治宜降氣順肺，氣降則痰自清。順氣化痰方中麻黃宣散外邪，石膏辛寒清熱，前胡、白前降氣化痰、止咳平喘，杏仁祛痰止咳、平喘，浙貝母清熱化痰、降氣止咳，紫菀潤肺下氣、消痰止咳，冬花潤肺養(yǎng)陰、化痰止咳，炙杷葉清肺和胃,降氣化痰，甘草清熱解毒、祛痰止咳。諸藥合用，具有降氣化痰、止咳平喘作用。本實驗結(jié)果顯示，順氣化痰方高、低劑量組血清IL-8、TNF-α水平和肺組織中MMP-2 mRNA、MMP-8 mRNA表達(dá)水平均明顯低于模型組，且順氣化痰方高劑量組各指標(biāo)水平均明顯低于順氣化痰方低劑量組；HE染色顯示順氣化痰方高、低劑量組肺氣腫情況明顯輕于模型組。提示順氣化痰方可減輕COPD大鼠肺組織病理改變,可能與減輕氣道炎癥有關(guān)。

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