富含血小板血漿明膠在脛骨粉碎性骨折愈合的應用

茹正良，吳明義，景孟軍

血小板是多種細胞因子和生長因子的儲存庫，這些細胞生長因子能促進血液凝固、組織修復和骨化過程。富含血小板血漿（PRP）是少量的血漿內包含大量的血小板成分的血制品，PRP通過生長因子例如血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子及轉化生長因子 等起促進成骨[1-3]，已成功應用于下頜骨和脊柱的骨移植手術、心血管手術和相關的代謝性骨疾病等[4]。以往研究中PRP應用于促進扁骨和松質骨骨折愈合，而且缺乏載體，本實驗研究PRP承載在明膠上對長骨粉碎性骨折的影響?，F(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1動物、試劑材料

1.1.1健康成年大鼠40只，雌雄不限，體質量400～600 g，均購自浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心。

1.1.2試劑 抗凝劑枸櫞酸鈉（浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院檢驗中心）；BMP-2、VEGF抗體、凝血酶（杭州厚愛生物技術有限公司）。

1.1.3材料 克氏針、鋼絲鋸、青霉素、注射器、血管鉗、復合碘、一次性無菌巾、無菌手套、無菌敷料、線剪、手術刀及縫合用針線等（浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院提供）。

1.2方法 將40只大鼠中4只作為取血源，剩下36只大鼠用隨機數(shù)字法分成實驗組和對照組，每組18只。

1.2.1PRP明膠制作 殺死4只大鼠，取全血60 ml，分別加入含有枸櫞酸鈉溶液的試管中，采用二次離心方法制備PRP。1 500 r/min離心20 min，巴氏管吸取上部的血漿及靠近界面1mm的紅細胞轉移到另一離心管中。進一步2000 r/min離心10min，可見在底部薄層的紅細胞上沉積有白膜樣物質，即為血小板沉積層；其上部為含有極少量未沉降血小板的血漿層。巴氏管吸取上部大部分血漿，剩下約0.5 ml血漿及血細胞成分。靜置30 min后輕輕振搖離心管，使紅細胞和血小板重懸于剩余的血漿中，即為PRP，最終得到全部的PRP 5 ml。將明膠海綿裁剪成0.5 cm小條，浸泡于PRP液中，即得到富PRP明膠。

1.2.2動物模型制備 36只大鼠行頭部及四肢固定于操作臺上，取右后肢常規(guī)方法脫毛滅菌，于脛骨中段處行長3 cm縱行切口，沿肌間隙游離脛骨，切開骨間膜及骨膜，近似橫行鋸斷脛骨，人為造成一處蝶形骨片，直視下遠近斷端完全分離，利用克氏針倒打釘技術復位并同時固定骨折斷端，沖洗創(chuàng)面，實驗組骨折線處覆上PRP明膠，對照組骨折處覆蓋空白明膠，逐層縫合，無菌紗布包扎。術后即下地，青霉素肌注3 d，隔日換藥，2周拆線。兩組大鼠分別在建模后1、2及4周行X線檢測，擬每個時間點兩組分別取6只行X線評價。

1.3觀察指標 骨痂X線評分標準：骨折斷端表現(xiàn)未見骨痂為Ⅰ級（0分）；斷端邊緣模糊，其骨膜反應較淺淡，有少量骨痂，密度淡，邊緣不平整為Ⅱ級（1分）；斷處邊緣已接近消失但仍可見，骨膜反應深，其骨痂量增多，未達到將缺損填滿，邊緣較清晰，密度增加為Ⅲ級（2分）；斷處邊緣已完全消失，其骨膜反應密度已近似骨影，缺損被骨痂填滿，并與骨皮質密度一樣且相互連接為Ⅳ級（3分）。免疫組化檢測：第1周大鼠死亡6只，第2周死亡2只。第1周分別取5、4只，第2周分別取5、5只，第4周取4、5只。將X線檢查后實驗大鼠殺死，以骨折斷端為中心取長2.0～3.0 cm的骨組織標本作免疫組化檢測。

1.4統(tǒng)計方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用 檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組骨痂大體形態(tài) 建模后對照組1只出現(xiàn)感染，3只（對照組2只，實驗組1只）傷口局部出現(xiàn)輕度的紅腫，應用抗生素和傷口換藥處理后愈合良好，其余未發(fā)現(xiàn)傷口局部異常情況；兩組在建模后1、2周時，均有不同程度纖維連接形成，第4周出現(xiàn)明顯骨痂；前2周大鼠骨折部位以纖維連接為主，實驗組的纖維連接強于對照組，兩組骨折線清晰，無明顯的骨痂生成；4周時兩組骨折線模糊，僅少量骨折部位骨折線清晰，骨折部位存在不等量的骨痂，且實驗組多于對照組。

2.2X射線檢測結果 建模后第1周兩組均無明顯的骨痂形成，兩骨折斷面清晰。第2、4周連續(xù)檢測發(fā)現(xiàn)骨折斷端逐漸模糊，骨痂影逐漸的增大，骨折部位出現(xiàn)了硬性骨痂。實驗組 X線評分（2.80±0.47）分，對照組（2.25±0.50）分，差異有統(tǒng)計學意義（=7.95＜ 0.05）。

2.3免疫組化結果 根據(jù)大鼠處死時間分為第一批、第二批及第三批。兩組第一批、第二批及第三批大鼠骨標本中BMP-2、VEGFA含量差異均有統(tǒng)計學意義（均＜0.05）；隨著時間推移，第三批BMP-2、VEGFA含量達到最高。見表1～2。

3　討論

本組采用二次離心方法制備PRP明膠，這種制備方法成熟簡便、易于操作，要求在盡可能無菌條件下完成，在制備的過程中盡可能減少不必要操作。明膠具有良好的生物相容性、生物降解性、骨傳導性及免疫原性低，有一定的強度及初性、高孔隙率。PRP承載于明膠能有效防止PRP流失，使細胞因子持續(xù)作用于骨折斷端。殺死大鼠取全血過程中，可能混雜有其他成分，這需要提高操作精度或者提升工藝來提純。

本研究動物模型取大鼠后肢脛骨中段，造成脛骨粉碎性骨折模型，這種骨折模型操作相對單純，更加符合臨床實際運用，易于在直視下將PRP明膠植入骨折部位并可以觀察植入情況。骨折模型建立后行克氏針內固定，這在解剖基礎上能夠加強骨折部位穩(wěn)定性，比石膏夾板外固定更加可靠。筆者在造模中碰到的主要問題是骨折類型的不一致，目的是大致橫斷骨折加一個蝶形骨片，橫斷骨折因為用鋸子還是很容易達成，但是用暴力制造蝶形骨片還是碰到了困難，很容易造成骨片的粉碎，后來臨時增加大鼠補足了實驗數(shù)目。

表1　骨痂中BMP-2含量表 g

表2　骨痂中VEGFA含量表 g

因為骨折的修復經(jīng)歷血腫形成、血腫機化、骨痂形成和骨痂改建4個階段。當成骨大于或等于破骨的時候，骨損傷的修復過程才能順利進行，當骨的穩(wěn)定受到破壞時，則需要新生骨組織修復創(chuàng)傷造成的缺損，此時可見大量毛細血管自骨折端長出，為骨修復提供所需的因子、細胞及養(yǎng)料，直至軟骨基質骨化并進一步形成骨組織[5]。在骨的生長及修復過程中，人們發(fā)現(xiàn)骨形成蛋白（BMP）是一類具有骨誘導性的因子，其中BMP-2是轉化生長因子 家族成員之一，具有誘導未分化間充質肝細胞向成軟骨細胞和成骨細胞定向轉化與增殖能力，具有促進成骨細胞分化成熟，參與骨和軟骨生長發(fā)育及其重建過程，進而加速骨折修復[6]。VEGF為特征性的內皮性生長因子，在體內體外，正常生長發(fā)育和病理過程中都可以特異性促進血管內皮細胞的增殖和誘導血管生成，包括內皮及內皮源性細胞、軟骨及骨細胞在內的多種細胞都可以分泌VEGF，其家族成員有VEGFA、胎盤生長因子（PLGF），VEGF-B、-C、-D和E[7]。通常所熟悉的VEGF—般是指VEGF-A，廣泛分布于各種組織以骨及心臟組織數(shù)量最多，有多種亞型，每種亞型都有各自不同的生物性能在血管生成中發(fā)揮相應作用[8]。

BMP對成骨的誘導為級聯(lián)過程，大致可分為4個階段[9]：（1）趨化階段。植入后0～3 d，局部基質干細胞的形態(tài)、行為和數(shù)量出現(xiàn)改變；（2）分化階段。植入后4～l0d，基質干細胞開始分化，可觀察到軟骨類細胞出現(xiàn)如軟骨祖細胞，伴隨多種結締組織細胞的遷移；（3）骨質形成階段。軟骨基質在植入后10～20d開始合成，并在植入物的有血管區(qū)發(fā)生軟骨內成骨，出現(xiàn)骨細胞并有沉積形成新生編織骨，軟骨組織形成于無血管區(qū)；（4）改建階段。植入后2～30d，新生骨趨于成熟，編織骨不斷重塑逐漸形成具有骨髓的板層骨。選擇第1、2及4周符合骨誘導周期，能更好地觀察其中的改變。

本實驗結果顯示 PRP具有明顯的促進骨折愈合作用，這顯示PRP作為自體生物材料優(yōu)勢。首先，取材特別廣泛，價格低廉；其次，具有很強安全性，能夠減少植入材料引起的一系列并發(fā)癥如疾病傳播和免疫反應等；另外，其制備過程簡單、易于操作。這些優(yōu)勢決定了PRP應用前景，但由于當前備PRP制備方法不同而導致了不同結果，這就對PRP作用產(chǎn)生很大爭議，限制了PRP應用前景。很多專家學者僅對單一細胞因子或2種細胞因子對骨折愈合或軟組織愈合作用影響進行研究，但少量卻種類眾多細胞因子對骨折局部共同作用機制仍不清楚，目前需要進一步完善PRP中細胞因子種類檢測及相關作用以及對骨折愈合過程作用（協(xié)同效應或抑制效應）。需進一步明確PRP應用于臨床后，在骨折局部持續(xù)具體時間，以及局部產(chǎn)生反應及如何反應等。伴隨著上述一系列問題解決，PRP將進一步應用于臨床并取得良好效果。

參考文獻：

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