沉默SLC34A2基因?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌CD166+干細(xì)胞生長的影響

郝登榮,席俊峰,張志斌,霍龍偉,任賀莊,席云峰

(陜西省榆林市第一醫(yī)院胸心外科,榆林　719000;*通訊作者,E-mail:ylylwzd@163.com)

肺癌在全世界的發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重威脅人類的生活和生存,給患者和患者家屬帶來很大的煩惱。肺癌可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),在治療的過程中發(fā)現(xiàn),SCLC的化療效果較好,但NSCLC對化療并不敏感,治療效果不好。因此,越來越多的學(xué)者將研究目光鎖定到了NSCLC,本課題組已經(jīng)從NSCLC中成功篩選出CD166+細(xì)胞[1],并驗證了其具有腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性。有研究顯示SLC34A2基因可能與肺癌細(xì)胞的生長有著密切的關(guān)系[2,3]。為研究SLC34A2基因是否對CD166+腫瘤干細(xì)胞的生長有調(diào)控作用,本實驗首先檢測了CD166+和CD166-細(xì)胞中的SLC34A2含量,然后沉默了CD166+細(xì)胞中SLC34A2基因,檢測沉默前后細(xì)胞的生長和增殖能力的變化,從而證實SLC34A2基因在肺癌細(xì)胞生長過程中所起的作用。

1　材料與方法

1.1　試驗細(xì)胞

在2015-09～2016-03期間,收集陜西省榆林市第一醫(yī)院胸心外科收治的兩位非小細(xì)胞癌患者的LCSCs,命名為LT1和LT7,并用流式細(xì)胞篩選出CD166+細(xì)胞和CD166-細(xì)胞,篩選完的所有細(xì)胞均由本實驗收集和保存,詳細(xì)方法見非小細(xì)胞肺癌CD166+干細(xì)胞的分離和鑒定[1]。臨床樣本中成功篩選出具有腫瘤干細(xì)胞特征的非小細(xì)胞肺癌CD166+細(xì)胞和CD166-細(xì)胞。

1.2　主要試劑和材料

Balb/c小鼠購于第四軍醫(yī)大學(xué),胰酶購自Sigma公司,TRIzol和LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司,培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司;胎牛血清購買于美國Hyclone公司;胰蛋白酶購買于美國Amersham公司;SLC34A2單克隆抗體購自Abcam。

1.3　測定CD166陽性細(xì)胞中SLC34A2的表達(dá)

針對登錄號為NG-021185.1的SLC34A2基因設(shè)計引物:上游引物為GAGAAACATCGCCAAATGC,下游引物為GCAACCACAGAGGACCAG。使用Trizol提取兩組細(xì)胞總的RNA,用逆轉(zhuǎn)錄酶合成為cDNA。然后用SYBR進(jìn)行real-time PCR,觀察結(jié)果。然后利用Western-blot檢測其蛋白的表達(dá)情況,收集兩組細(xì)胞提取膜蛋白,蛋白樣品采用Bradford法測定總蛋白含量。根據(jù)蛋白樣品的濃度,計算出每孔中蛋白質(zhì)樣品的體積。SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h,加入小鼠抗人SLC34A2抗體(1 ∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗10 min，共3次，用HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1 ∶10 000稀釋)，室溫孵育2 h，用ECL發(fā)光試劑盒曝光，觀察結(jié)果。

1.4　篩選沉默SLC34A2基因的細(xì)胞

上海吉瑪生物有限公司化學(xué)合成3條針對SLC34A2序列的siRNA,本實驗從中篩選出一條有效的siRNA序列,正義鏈:5′-CTCCCTGGATATTCTTAGTT-3′,Free-Rnase將濃度稀釋為20 μmol/L,隨后將生長對數(shù)期的兩組細(xì)胞用胰蛋白酶消化,把細(xì)胞濃度調(diào)整為1.5×105個/孔,接種在6孔板,參照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。篩選出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞株。試驗共分三組,一組為未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組(LCSCs),一組為轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞組(si-NC-LCSCs),一組為實驗組(si-SLC34A2-LCSCs)。

1.5　細(xì)胞成球?qū)嶒?/h3>

將三組細(xì)胞在相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng),等待細(xì)胞生長到對數(shù)期取出細(xì)胞,準(zhǔn)備實驗,用胰酶消化,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中,低速(1 000 r/min)離心3 min后去上清。然后向離心管內(nèi)加入5 ml的PBS,輕輕吹打細(xì)胞使之重懸,再次離心;重懸離心操作需要重復(fù)3次,然后用培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為1 000個/ml,然后細(xì)胞接種在6孔板上,進(jìn)行腫瘤成球培養(yǎng)。需要3 d更換培養(yǎng)液1次,接種后14 d觀察實驗結(jié)果。

1.6　集落形成能力檢測

將三組細(xì)胞的濃度調(diào)整為250個/ml,并將細(xì)胞接種在6孔板上,每組細(xì)胞需要做兩個重復(fù)孔,加入2 ml Defined K-SFM培養(yǎng)基,3 d更換培養(yǎng)液1次,兩周后用2 %的結(jié)晶紫染色,沖洗后計數(shù)每孔中細(xì)胞集落的數(shù)目。

1.7　裸鼠體內(nèi)移植瘤試驗

將8-9周的Balb/c小鼠平均分為3組(每組6只),取沉默SLC34A2基因的CD166+細(xì)胞的懸液(1×104/ml)0.5 ml,腹腔注射到小鼠體內(nèi),在相同的條件進(jìn)行飼養(yǎng),以便獲得真實可靠的數(shù)據(jù),注射后持續(xù)對小鼠腹腔內(nèi)的腫瘤情況進(jìn)行追蹤,從接種第10天開始測量裸鼠腹腔內(nèi)腫瘤的生長情況,直到第35天處死小鼠,并對腫瘤的體積進(jìn)行記錄和比較。

1.8　統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　real-time PCR和Western-blot的檢測結(jié)果

檢測臨床病例分離出的CD166+細(xì)胞和CD166-細(xì)胞的SLC34A2基因表達(dá)量,real-time PCR檢測結(jié)果表明:CD166+細(xì)胞的SLC34A2的含量顯著高于CD166-細(xì)胞(P<0.01,見圖1);Western blot結(jié)果顯示CD166+細(xì)胞的SLC34A2的表達(dá)高于CD166-(P<0.05,見圖2)。

與CD166+比較,**P<0.01圖1　real-time PCR檢測SLC34A2在CD166+和CD166-的表達(dá)Figure 1　Relative expression of SLC34A2 in CD166+and CD166-cells by real-time PCR

圖2　SLC34A2在CD166+和CD166-蛋白水平的表達(dá)Figure 2　Protein expression of SLC34A2 in CD166+and CD166-cells

2.2　沉默SLC34A2基因的變化

沉默LT1和LT7兩組CD166+細(xì)胞中SLC34A2基因后,檢測每一組細(xì)胞中SLC34A2基因的表達(dá)量,結(jié)果表明與空白對照(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的LCSCs)和陰性對照組(轉(zhuǎn)染空載體的LCSCs)相比,CD166+細(xì)胞中SLC34A2表達(dá)顯著降低(P<0.05,見圖3)。另外,細(xì)胞成球?qū)嶒灲Y(jié)果顯示,CD166+細(xì)胞球形成的個數(shù)19.4±1.8,轉(zhuǎn)染空載體的CD166+細(xì)胞球形成的個數(shù)16.4±2.1,沉默SLC34A2基因的CD166+細(xì)胞成球形成的個數(shù)為4.2±1.5,結(jié)果顯示沉默SLC34A2基因的CD166+細(xì)胞成球顯著能力低于其他兩組細(xì)胞(P<0.05,見圖4)。

與其他兩組比較,*P<0.05圖3　real-time PCR檢測沉默SLC34A2的變化　Figure 3　The change of SLC34A2 in CD166+ cells after transfection by real-time PCR

圖4　沉默SLC34A2后腫瘤細(xì)胞成球能力的變化Figure 4　The proliferation ability of tumor cells after silencing SLC34A2

2.3　沉默SLC34A2對集落形成能力的影響

集落形成實驗表明,CD166+細(xì)胞形成的集落數(shù)為104±9.2,轉(zhuǎn)染空載體的CD166+細(xì)胞形成的集落數(shù)為113±10.4,沉默SLC34A2基因的CD166+細(xì)胞形成的集落數(shù)為40±9.8,結(jié)果顯示空白對照(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的LCSCs)的細(xì)胞形成的集落直徑較大,細(xì)胞排列緊密,而沉默SLC34A2基因的CD166+細(xì)胞集落形成能力顯著低于空白對照(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的LCSCs)和陰性對照組(轉(zhuǎn)染空載體的LCSCs)(P<0.05,見圖5)。

2.4　沉默SLC34A2對體內(nèi)移植瘤的影響

用三組細(xì)胞懸液接種小鼠,分別測量各個時間段的腫瘤大小。接種的前20 d,三組細(xì)胞形成的腫瘤較小,且腫瘤體積較為接近,在接種后25 d,未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞組腫瘤的體積持續(xù)增加,而實驗組(沉默SLC34A2基因)腫瘤的體積不再增加。接種后35 d,腫瘤大小出現(xiàn)明顯差異,未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體的CD166+細(xì)胞懸液接種后,產(chǎn)生的腫瘤沒有明顯差異,而接種沉默SLC34A2基因的CD166+細(xì)胞懸液后,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的腫瘤體積顯著小于其他兩組小鼠腫瘤的體積(P<0.01,見圖6)。

圖5　集落形成實驗結(jié)果Figure 5　The experiment results of colony formation

圖6　體外腫瘤實驗結(jié)果Figure 6 The changes of tumor size in in vitro expriments after silencing SLC34A2

3　討論

SLC34A2廣泛存在于各個組織器官中,但其在各個組織的表達(dá)略有不同,有學(xué)者[4]在1999年檢測得出存在于小腸中的SLC34A2基因的cDNA長度為4 135 bp,編碼689個氨基酸,其中包含11個跨膜區(qū)域;SLC34A2基因在肺和胎肺中高表達(dá),而土耳其的學(xué)者則發(fā)現(xiàn),存在于肺組織中的SLC34A2基因共有13個外顯子,其中第一個外顯子編碼了一個大小為690 aa的蛋白質(zhì)以及一個2 280 nt的mRNA[5-7]。日本的研究者在16個PAM臨床樣本中檢測到了SLC34A2基因發(fā)生了突變,這更加驗證了SLC34A2基因在疾病的發(fā)生和發(fā)展中的重要性。有數(shù)據(jù)顯示[8,9],在甲狀腺癌和正常人甲狀腺的差異表達(dá)基因中發(fā)現(xiàn)了SLC34A2基因,且在乳頭狀甲狀腺癌中該基因明顯高表達(dá)。

此外,在卵巢癌血清中也有研究人員發(fā)現(xiàn)了SLC34A2基因的存在[10,11],而且SLC34A2參與鈣、磷的協(xié)同轉(zhuǎn)運。最初在惡性膠質(zhì)瘤及非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中,ROS-SLC34A2融合基因發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)腫瘤的生長的作用[12-14],有學(xué)者認(rèn)為這也許與CICs的增殖、侵襲能力有一定的關(guān)系[15,16],而且進(jìn)行深入研究,沉默SLC34A2之后,發(fā)現(xiàn)NaPi-Ⅱ表達(dá)降低,也可抑制肺癌干細(xì)胞的增殖[17-19]。同時還有數(shù)據(jù)表明SLC34A2可能與肺癌的進(jìn)展相關(guān),可以在一定程度上抑制肺癌干細(xì)胞的增殖[20,21],故該次實驗選取SLC34A2為研究對象,研究其對NSCLC的影響。

本課題組已經(jīng)驗證了CD166+腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性,及與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但其致病機制并不明確。結(jié)果表明CD166+細(xì)胞中的SLC34A2顯著高于CD166-細(xì)胞;之后沉默SLC34A2基因后,通過細(xì)胞成球?qū)嶒?、?xì)胞集落實驗以及體外小鼠實驗,這些實驗都表明:沉默SLC34A2基因后,腫瘤細(xì)胞的生長和增殖能力顯著下降,這些實驗結(jié)果暗示著SLC34A2基因高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤的生長。

綜上所述,CD166及SLC34A2基因在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要意義,檢測CD166及SLC34A2基因有利于腫瘤的診斷,并可對患者的治療提供新的依據(jù),從而改善患者預(yù)后。本研究的結(jié)果希望能對NSCLC晚期患者的個體化治療方案的選擇有所幫助。SLC34A2在肺癌的發(fā)展過程中有著重要的地位,但是該基因在肺癌的發(fā)展過程中是通過哪條信號通路對其進(jìn)行調(diào)控,以及在整個的過程中是否還有其他的基因進(jìn)行調(diào)控還需要我們進(jìn)行下一步的研究。

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