藍(lán)光和黑暗培養(yǎng)淡紫擬青霉形態(tài)及產(chǎn)孢量差異

李貴正 張營 鄭樹林 劉永慶

摘要：實(shí)驗(yàn)室完全黑暗和持續(xù)藍(lán)光培養(yǎng)淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus），觀察營養(yǎng)生長及無性生殖形態(tài)差異。結(jié)果表明，藍(lán)光對擬青霉?fàn)I養(yǎng)生長影響較小，藍(lán)光感光期為培養(yǎng)36～96 h，藍(lán)光使產(chǎn)孢期提前20 h，使分生孢子產(chǎn)量增加145.9%；中試對實(shí)驗(yàn)室結(jié)論進(jìn)行了初步驗(yàn)證，藍(lán)光使分生孢子產(chǎn)量增加36.8%，藍(lán)光和黑暗發(fā)酵產(chǎn)品分生孢子成活率無差異。

關(guān)鍵詞：藍(lán)光；淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）；形態(tài)差異；分生孢子產(chǎn)量

中圖分類號：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）04-0036-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.04.009

The Form and Spore Yield Differentia of Paecilomyces lilacinus

under Blue Light and Darkness

LI Gui-zheng， ZHANG Ying， ZHENG Shu-lin， LIU Yong-qing

（Kingenta Ecological Engineering Group Co.，Ltd.， Linyi 276700，Shandong，China）

Abstract： The form and spore yield differentia under total darkness and continuous blue light were observed in laboratory. The results showed that the continuous blue light had little affection on the growth period，while the blue photophase was between 36～96 h，and it was 20 h earlier to produce spore than darkness and the yield of spore increased 145.9% under blue light； Pilot tests were experimented to prove the conclusion，and the yield of spore increased 36.8% under blue light. The spore rate of survival under total darkness and continuous blue light was no difference.

Key words： blue light； Paecilomyces lilacinus； form differentia； spore yield

淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）是土壤中植物線蟲的一種兼性寄生真菌，它主要通過分生孢子寄生于線蟲卵使其不能孵化出幼蟲而達(dá)到殺蟲目的，因此其有效成分是活性分生孢子[1]。藍(lán)光是一種很重要的環(huán)境信號，它能調(diào)節(jié)大多數(shù)微生物尤其是真菌的生長和代謝。研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)光主要影響真菌的新陳代謝、生長、有性和無性生殖過程、色素形成和向性運(yùn)動等[2]。藍(lán)光能顯著提高真菌分生孢子產(chǎn)量，玫煙色擬青霉持續(xù)藍(lán)光培養(yǎng)產(chǎn)生的分生孢子量較完全黑暗培養(yǎng)提高109倍[3]。淡紫擬青霉作為生物肥藥已在世界范圍內(nèi)用于線蟲防治，但行業(yè)普遍存在發(fā)酵產(chǎn)孢量不高的問題，用傳統(tǒng)手段大幅度提高產(chǎn)孢量較困難，如何大幅度提高產(chǎn)孢量仍是一個迫切需要解決的難題。本試驗(yàn)嘗試將藍(lán)光應(yīng)用于擬青霉發(fā)酵，既為擬青霉發(fā)酵引入光調(diào)控提供依據(jù)，又為采用科學(xué)合理工藝條件提高真菌分生孢子產(chǎn)量找到新的技術(shù)突破口。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 淡紫擬青霉購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 PDA培養(yǎng)基（單孢子培養(yǎng)觀察時原配方用無菌水稀釋3倍，目的是調(diào)整培養(yǎng)基硬度和降低營養(yǎng)物濃度）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 7.0，26 ℃培養(yǎng)。

中試搖瓶培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH 7.0，160 r/min，28 ℃培養(yǎng)36 h。

中試液體培養(yǎng)基：3%玉米粉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），0.5%葡糖糖，0.4%硝酸鈉，0.1%磷酸二氫鉀，0.3%七水硫酸鎂，0.05%氯化鈣；pH 6.5；接種量0.5%（V/V）；通氣比：0～15 h，0.6 m3/（m3·min），16～30 h，1 m3/（m3·min），31～48 h，0.8 m3/（m3·min）；28 ℃培養(yǎng)72 h，使液體菌絲體產(chǎn)孢[4]。

中試固體培養(yǎng)基：玉米秸稈、玉米粉和麩皮質(zhì)量比1∶1∶1，1%蔗糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），1.5%硫酸銨，0.15%硫酸鎂，0.1%碳酸鈣；物料121 ℃滅菌40 min；接種量48%（V/m）；調(diào)整含水量60%～64%；通氣比：0～24 h不通氣，25～72 h 0.6 m3/（m3·min），73～144 h 0.3 m3/（m3·min）；26 ℃培養(yǎng)144 h。

1.1.3 光源 20 W藍(lán)色熒光燈，由廣州燈泡廠生產(chǎn)，將藍(lán)色光源通過藍(lán)色濾膜（#73）（日本株式會社生產(chǎn)的截止型濾膜）獲得較純凈的藍(lán)光，藍(lán)光最強(qiáng)波長450 nm，放于瓊脂表面20 cm處或固體培養(yǎng)基表面30 cm處，光密度約10～12 μmol/（m2·s）；實(shí)驗(yàn)室黑暗培養(yǎng)時培養(yǎng)皿用鋁箔包扎，固態(tài)發(fā)酵黑暗培養(yǎng)過程培養(yǎng)箱用黑布完全遮蓋，培養(yǎng)溫度為（26±1）℃[5]。

1.1.4 主要試劑、儀器和設(shè)備 Whatman濾紙（孔徑10 μm，England），凹玻片，玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管（長度100 mm，內(nèi)徑0.3 mm，四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心），直徑9 cm的布氏漏斗，U形玻璃棒，乳酸石碳酸棉蘭染色液，20%甘油，0.03%Tween-80，Nikon-ECLIPSE-50i光學(xué)顯微鏡（日本），Nikon數(shù)碼相機(jī)（日本），哈東聯(lián)DLHR-X250搖床，液體發(fā)酵罐（200 L，江蘇科海生物工程設(shè)備有限公司），固體滅菌罐（2 000 L，江蘇科海生物工程設(shè)備有限公司），固體培養(yǎng)箱（自制；長、寬、高分別為450、220、200 cm；內(nèi)裝8輛物料車；每車裝24個盤；培養(yǎng)箱內(nèi)每面裝藍(lán)光燈管2根），淺盤（自制，長、寬、高分別為64、46、3 cm）。

1.2 方法

1.2.1 菌落形態(tài)觀察法 淡紫擬青霉培養(yǎng)7 d，紅光燈下培養(yǎng)皿內(nèi)加入滅菌的0.03% Tween-80溶液，玻璃涂布器刮下菌落，用10 μm孔徑的Whatman濾紙過濾，血球板計(jì)數(shù)得到106個孢子/μL的孢子懸液；每皿接種5 μL孢子懸液；藍(lán)光培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿放于培養(yǎng)箱藍(lán)光管下20 cm處，調(diào)整培養(yǎng)箱溫度使瓊脂表面溫度為26 ℃。黑暗培養(yǎng)時，鋁箔包扎好后置于培養(yǎng)箱中26 ℃培養(yǎng)；培養(yǎng)6 d后拿出用Nikon數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.2.2 單孢子生長觀察法 采用凹玻片法[6]獲得單孢子，完全黑暗和藍(lán)光分別培養(yǎng)，菌落用乳酸石碳酸棉蘭染色，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 分生孢子計(jì)數(shù)法 采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法[7]，培養(yǎng)皿中加入滅菌的0.03% Tween-80溶液，用玻璃涂布器刮下菌落，稀釋50～100倍顯微計(jì)數(shù)；稱取5 g固態(tài)發(fā)酵物料，加滅菌的0.03% Tween-80溶液，稀釋500～2 500倍顯微計(jì)數(shù)。

1.2.4 藍(lán)光光敏期確定法 按照“1.2.1”方法接種36個培養(yǎng)皿；接種后3個培養(yǎng)皿進(jìn)行12 h藍(lán)光照射，其余33個培養(yǎng)皿用鋁箔紙包扎好使完全黑暗培養(yǎng)，藍(lán)光照射后3個培養(yǎng)皿用鋁箔包扎使完全黑暗培養(yǎng)；每隔12 h依次給予3個培養(yǎng)皿藍(lán)光照射，這3個培養(yǎng)皿其余時間完全黑暗培養(yǎng)；培養(yǎng)6 d后拿出培養(yǎng)皿，刮下菌落進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)，參考完全黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)的分生孢子數(shù)確定光敏期。

1.2.5 驗(yàn)證黑暗和藍(lán)光產(chǎn)品成活率差異法 采用萌發(fā)率來衡量，萌發(fā)率=涂布平板計(jì)數(shù)結(jié)果/顯微鏡直接計(jì)數(shù)結(jié)果。涂布平板計(jì)數(shù)法按GB 20287-2006農(nóng)用微生物菌劑執(zhí)行。固態(tài)發(fā)酵物料常溫保存，取2～6個月的保存物料，采取多點(diǎn)取樣法稱取物料5 g，分別用顯微鏡直接計(jì)數(shù)和涂布平板計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)

藍(lán)光對菌落生長影響不大，藍(lán)光和黑暗培養(yǎng)的菌落直徑無明顯差別（表1）。兩種條件培養(yǎng)的菌落形態(tài)差別明顯，藍(lán)光培養(yǎng)的菌落中央有明顯突起，突起部分菌絲直立向上生長，呈花蕊狀，菌落表面絨毛狀氣生菌絲體較多（圖1A），這與Miyake等[2]對紅曲霉（Monascus）的觀察結(jié)果基本一致；黑暗培養(yǎng)的菌落中央圓形突起呈扁平狀，表面絨毛狀菌絲體較少（圖1B）。

2.2 單孢子生長觀察結(jié)果

藍(lán)光對分生孢子萌發(fā)無影響，藍(lán)光、黑暗兩種條件培養(yǎng)的分生孢子均在8～12 h萌發(fā)（圖2A、圖2B）；藍(lán)光培養(yǎng)菌絲較粗，且致密，48 h菌落產(chǎn)生大量分生孢子（圖3A）；黑暗培養(yǎng)菌絲較細(xì)，且較疏松，68 h才有分生孢子產(chǎn)生（圖3B）。

2.3 分生孢子計(jì)數(shù)結(jié)果

藍(lán)光能明顯促進(jìn)產(chǎn)孢，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)皿培養(yǎng)計(jì)數(shù)藍(lán)光比黑暗增產(chǎn)145.9%（表2），中試固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)藍(lán)光比黑暗增產(chǎn)36.8%（表3）。

2.4 藍(lán)光光敏期結(jié)果

由圖4可知，完全黑暗培養(yǎng)產(chǎn)孢量3.51億/g，持續(xù)藍(lán)光培養(yǎng)產(chǎn)孢量8.63億/g，與各階段藍(lán)光照射后產(chǎn)孢量對比得出淡紫擬青霉感光期。表明淡紫擬青霉光敏期在36～96 h。

2.5 黑暗與藍(lán)光發(fā)酵產(chǎn)品成活率差異

黑暗與藍(lán)光發(fā)酵產(chǎn)品經(jīng)6個月室溫保存后萌發(fā)率無明顯差異，表明通過藍(lán)光提高分生孢子產(chǎn)量的方法是可行的（表4）。黃永兵等[8]用玉米秸稈生產(chǎn)淡紫擬青霉，發(fā)酵產(chǎn)品室溫貯存2～11個月，孢子萌發(fā)率達(dá)90%左右，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3 小結(jié)與討論

實(shí)驗(yàn)室藍(lán)光促進(jìn)產(chǎn)孢效果明顯好于中試，推測藍(lán)光穿透力差導(dǎo)致培養(yǎng)箱內(nèi)物料接受藍(lán)光照射不均勻和光照強(qiáng)度小。持續(xù)藍(lán)光和完全黑暗發(fā)酵產(chǎn)品成活率無明顯差異，表明通過藍(lán)光培養(yǎng)提高產(chǎn)孢量的方法是可行的。微生物農(nóng)藥使用時分生孢子數(shù)量僅是一個方面，分生孢子寄生活性相當(dāng)關(guān)鍵，發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行線蟲寄生試驗(yàn)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

生物肥藥擬青霉與化學(xué)殺蟲劑相比，具有對人畜安全無毒和不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，對植物生長有一定促進(jìn)作用，因此有著廣闊的應(yīng)用前景，是很具有發(fā)展前途的產(chǎn)業(yè)[9]。藍(lán)光對淡紫擬青霉?fàn)I養(yǎng)生長影響不大，能明顯增加產(chǎn)孢量，并能促使產(chǎn)孢期明顯提前，推測藍(lán)光可能創(chuàng)造一個單純而均一的脅迫環(huán)境，促使菌絲體營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長。本試驗(yàn)將藍(lán)光作為一種有效的手段應(yīng)用于淡紫擬青霉發(fā)酵生產(chǎn)，可為真菌提高分生孢子產(chǎn)量找到一種新的技術(shù)突破口。

參考文獻(xiàn)：

[1] 姜培增，李宏園，陳鐵保.淡紫擬青霉防治植物線蟲研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2006，8（6）：38-41.

[2] MIYAKE T，MORI A，KII T，et al. Light effects on cell development and secondary metabolism in Monascus[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2005，32（3）：103-108.

[3] S？魣NCHEZ-MURILLO R I，TORRE-MART？魱NEZ M DE L，AGUIRRE J，et al. Light-regulated asexual reproduction in Paecilomyces fumosoroseus[J].Microbiology，2004，150：311-319.

[4] 劉杏忠，劉文敏，張東升.定殖于大豆胞囊線蟲的淡紫擬青霉生物學(xué)特性研究[J].中國生物防治，1995，11（2）：70-74.

[5] 朱俊晨，王小菁.藍(lán)光促進(jìn)黑曲霉分生孢子發(fā)育和產(chǎn)糖化酶的研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2005，45（2）：275-278.

[6] 李貴正，劉紀(jì)臣，李新柱，等.1種創(chuàng)新單孢子分離及霉菌生長形態(tài)觀察方法[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：390-391.

[7] 沈 萍，范秀榮，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，1996.

[8] 黃永兵，肖炎農(nóng)，黃 蓉，等.應(yīng)用玉米秸稈生產(chǎn)淡紫擬青霉36-1菌株孢子[J].中國生物防治，2007，23（4）：338-342.

[9] 林茂松，沈紀(jì)冬，文 玲，等.淡紫擬青霉代謝產(chǎn)物生理活性物質(zhì)分析和生物測定[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)1999，14（S1）：70-74.