一株鴨源禽流感病毒(H9N2)全基因序列分析及其排毒規(guī)律的研究

楊玲玲，牛 凱，王 濤，王曉藝，常維山*，劉玉慶

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安 271018; 2.煙臺市牟平區(qū)姜格莊街道畜牧獸醫(yī)工作站，山東煙臺 264114; 3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南 250100; 4.山東省濰坊市濰城區(qū)畜牧獸醫(yī)管理局，山東濰坊 261000)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正黏病毒科流感病毒屬的A型流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的一種急性接觸性傳染病，呈世界性發(fā)生和流行。目前已知的禽流感有16個HA亞型和9個NA亞型[1]。自1994年我國首次報道雞群分離到H9N2亞型AIV以來[2]，H9N2亞型低致病性AIV廣泛存在于我國大部分地區(qū)[3]。雞、火雞、鴨、鵝和鵪鶉等家禽及野鳥、水禽、海鳥等均可感染[4]。家鴨被認(rèn)為是AIV的巨大儲存庫，在AIV由野生水禽到陸生禽類的傳播過程中充當(dāng)中間媒介的作用。自1999年H5N1亞型高致病性禽流感病毒引起鴨、鵝高發(fā)病率和高致死率，打破了對水禽僅為流感病毒的攜帶者而不發(fā)病死亡的傳統(tǒng)認(rèn)識[5-6]。

實驗研究了一株從發(fā)病鴨體內(nèi)分離到的H9N2亞型AIV，命名為JN1株。通過對該H9N2亞型AIV進(jìn)行全基因序列測定及遺傳進(jìn)化分析，明確了其全基因特征和遺傳進(jìn)化關(guān)系，利用點(diǎn)眼滴鼻人工接種3周齡雛鴨，研究H9N2亞型AIV感染雛鴨后的排毒規(guī)律及雛鴨感染后的抗體水平，為預(yù)防和控制禽流感的發(fā)生提供參考。

1　材　料

1.1病毒及實驗動物毒株來自濟(jì)寧送檢樣品，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)細(xì)胞免疫實驗室分離，命名為JN1株。SPF種蛋購自山東省家禽研究所。試驗用雛鴨購自山東省泰安市某孵化場。H5、H9N2亞型禽流感血凝抑制試驗標(biāo)準(zhǔn)抗原與標(biāo)準(zhǔn)血清購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2主要儀器與試劑7500型熒光定量PCR儀(ABI公司)；TRIzol UP、Taq DNA聚合酶、dNTPs、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SanProp柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit、PMD18-T Vetor、SYBR Premix EX TaqTM、PrimerScriptTMRT Reagent Kit、PMD18-T Vector Cloning Kit購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3引物的設(shè)計與合成用于熒光定量PCR的H9N2亞型禽流感HA基因(KY212947)cDNA的擴(kuò)增引物為：HA-F:TCGGAACGGGACCTACAATA，HA-R:CACAAGAGATGAGGCGACAG；內(nèi)參基因β-actin(M26111)cDNA的擴(kuò)增引物為：β-actin-F:ACTTCTGTTGCTGCCGTTCT，β-actin-R:AGCCCCGTGATGGTTACTG。利用Primer5.0軟件設(shè)計，引物自身不形成二級結(jié)構(gòu)，引物間沒有互補(bǔ)序列。用于擴(kuò)增H9N2亞型AIV全基因的引物是根據(jù)GenBank上公布的禽源H9N2亞型AIV全基因序列并參照孟芳等[7]發(fā)表的引物進(jìn)行設(shè)計，所有引物由上海生工生物有限公司合成。

2　方　法

2.1生物學(xué)特性測定取新鮮病毒尿囊液，按照國際獸醫(yī)局(OIE)方法進(jìn)行雞胚半數(shù)感染量(EID50)、雞胚最小致死量的平均死亡時間(MDT)、靜脈致病指數(shù)(IVPI)的測定。

2.3JN1株全基因測序與序列分析參照TRIzol UP說明書提取病毒RNA，用流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni12(5'-AGCAAAAGCAGG-3')，按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠回收和純化后連接至PMT18-T載體轉(zhuǎn)入DH5α，用PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，將陽性重組質(zhì)粒送由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。應(yīng)用Lasergene 7.1軟件拼接測序的基因片段并推導(dǎo)氨基酸序列，構(gòu)建8個基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，同時對其編碼的氨基酸進(jìn)行分析，最后將序列上傳至NCBI。實驗用的參考株分別為DK/HK/Y280/97(AF156376)、CK/SH/F/98(AF461532)、CK/BJ/1/94(KF188294)、Qa/HK/G/97(AF156378)、Ty/Wisconsin/1/66(AB295601)、DK/HK/Y439/97(KF188265)。

2.4JN1株排毒規(guī)律的研究

2.4.1試驗分組與攻毒20只3周齡健康雛鴨，通過點(diǎn)眼滴鼻途徑每只接種1 mL病毒尿囊液(107.84EID50/只)。于感染后0、2、3、5、7、9、11、13、15、17 d采集泄殖腔以及咽拭子，用于排毒規(guī)律的測定；于感染后第7、11、14、17、20天經(jīng)頸靜脈隨機(jī)采集5只雛鴨的血液分離血清，參照OIE (2008) 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行 HA/HI-test 測定抗體滴度。所有樣品置于-20 ℃冰箱保存。

2.4.2樣品棉拭子熒光定量PCR檢測參照TRIzol UP說明書提取棉拭子中病毒RNA，用分光光度計測定RNA純度和濃度，合成cDNA。按照建立的熒光定量PCR檢測方法，對樣品進(jìn)行檢測并對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

3　結(jié)　果

3.1生物學(xué)特性測定JN1株EID50為10-7.54/0.2 mL，MDT為72 h，IVPI為0.26，表明該毒株為低致病力毒株。

3.3JN1株全基因序列分析

3.3.1全基因核酸序列比較將JN1株8個基因序列提交到GenBank，登錄號為KY212942-KY212949。JN1株的全基因序列與GenBank上公布的多個H9N2亞型AIV的全基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示，JN1株的各個基因與GenBank上下載的H9N2毒株的核苷酸的相似性范圍：HA 80.3%～98.0%、NA 83.3%～99.6%、M 92.3%～100%、NP 89.1%～99.7%、NS 91.0%～98.3%、PA 87.4%～99.7%、PB1 89.8%～99.8%、PB2 84.2%～99.6%(表1)。

3.3.2HA基因上關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析JN1株 HA基因片段長1690 bp，具有完整的開放閱讀框，編碼560個氨基酸。氨基酸序列分析表明：JN1株的HA裂解位點(diǎn)處的氨基酸序列為PSRSSR↓GL仍符合低致病性H9N2亞型AIV的特點(diǎn)。HA受體結(jié)合位點(diǎn)與DK/HK/Y280基本一致，僅在198位不同；受體結(jié)合位點(diǎn)左側(cè)壁(232-237)為NGLMGR，右側(cè)壁為GTSTA。第234位氨基酸殘基為Leu，具有同哺乳動物唾液酸α-2，6受體結(jié)合的特性。利用NetNGlyc1.0分析HA基因潛在的糖基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn) JN1株中存在6個潛在糖基化位點(diǎn)，與DK/HK/Y280相比，缺少了218～220位NRT位點(diǎn)和551～553位NGS位點(diǎn)，增加了313～315位NCS位點(diǎn)(表2)。

3.3.3NA上關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析JN1株NA基因片段長度1457 bp，編碼466個氨基酸。氨基酸序列分析表明：JN1株缺少63～65位T、E、I三個氨基酸殘基，這一缺失導(dǎo)致JN1株減少了61～63位潛在的糖基化位點(diǎn)。紅細(xì)胞吸附位點(diǎn)分析表明：NA基因紅細(xì)胞吸附位點(diǎn)367～372位點(diǎn)處為KKDSRS，400～403位點(diǎn)處為SDNW，431～433位點(diǎn)處為PQE，與歐亞經(jīng)典毒株基本一致，研究表明，此區(qū)域?qū)A的酶活性具有重要的作用[8](表3)。

表1　JN1株與流感病毒主要參考株的核苷酸相似性比較Tab 1　Comparison of nucleotide similarity of JN1with influenza virus reference strains

表2　HA蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸序列比較Tab 2　Comparison of the key amino acid residues in the amino acid sequence of HA protein

+：具有與DK JN 1株相同的糖基化位點(diǎn)；-：糖基化位點(diǎn)缺失

+：Contain the same potential glycosylation sites as DK JN1; -：Lost potential glycoslation sites

表3　NA蛋白糖基化位點(diǎn)及紅細(xì)胞吸附位點(diǎn)氨基酸序列分析Tab 3　Comparison of potential glycosylation sites and HB sites in the amino acid sequence of NA protein

+：具有與DK JN 1株相同的糖基化位點(diǎn)；-：糖基化位點(diǎn)缺失

+：Contain the same potential glycosylation sites as DK JN1; -：Lost potential glycoslation sites

3.3.4JN1株P(guān)B2、PB1和PA基因的序列分析PB2基因627位氨基酸的變化對于病毒感染哺乳動物有著極大的影響，禽源PB2的第627位谷氨酸(Glu，E)突變?yōu)橘嚢彼?Lys，K)時，病毒能在小鼠體內(nèi)高效復(fù)制[9]。JN1株P(guān)B2基因片段長度為2280 bp，編碼760個氨基酸，627位不存在突變。PB1中的L13P和S678N的氨基酸差異是導(dǎo)致對小鼠致病力增強(qiáng)的關(guān)鍵，JN1株的13位出現(xiàn)了L/P的變異，但678位仍為S，表明JN1株對小鼠的致病力有增強(qiáng)的趨勢。PA基因中的S224P和N383D突變，能夠增強(qiáng)H5N1亞型AIV對鴨的致病力[10]，而JN1株為S224和383D。

3.3.5JN1株M、NP、和NS基因的序列分析JN1株M基因片段長度1027 bp，編碼有完整的M1和M2蛋白。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)JN1株M2蛋白在31位S上發(fā)生了N的取代。NP基因蛋白的A184K變異可能在影響禽流感病毒的繁殖與致病力方面具有關(guān)鍵的作用[11]，而N319K的變異可能是對小鼠致病力增強(qiáng)的關(guān)鍵[12]，JN1株184位為K，319位則為N。JN1株的NS1的第92位氨基酸為D，具有目前國內(nèi)雞源H9N2毒株的典型特征。149位為A，而非V，具有與高致病性AIV相關(guān)的NS基因特征。

3.3.6JN1株各基因的系統(tǒng)發(fā)生樹分析為了進(jìn)一步探究JN1株AIV各基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系，應(yīng)用MegAlign軟件，繪制了JN1株8個基因片段的系統(tǒng)發(fā)育基因進(jìn)化樹。JN1株HA屬于以CK/HK/G9/97和DK/HK/Y280/9毒株為代表的Ⅰ群(G9群)。參考C Li 等[13]對中國分離的H9亞型AIV的系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果，NA、M、NP、PA、PB1、PB2基因位于系統(tǒng)發(fā)育樹的SH/F/98-like分支。NS基因經(jīng)Blast對比，發(fā)現(xiàn)其與H5N1亞型AIV進(jìn)化關(guān)系較近，說明本分離JN1株NS基因可能由H5N1傳播而來(圖1-圖4)。

3.4雛鴨感染JN1株AIV病毒后的排毒規(guī)律在試驗過程中，攻毒雛鴨未出現(xiàn)死亡情況，無明顯臨床癥狀。利用實驗室建立的熒光定量檢測方法對攻毒樣品進(jìn)行檢測。雛鴨泄殖腔棉試子與咽拭子熒光定量PCR檢測結(jié)果見圖5，可以看出，雛鴨感染AIV病毒后，泄殖腔棉拭子和咽拭子的排毒規(guī)律基本一致。在攻毒后第2天即可檢測到排毒，在檢測過程中，出現(xiàn)了兩個排毒高峰，無論是泄殖腔棉拭子還是咽拭子，均在第3 天達(dá)到排毒高峰，在第11天排毒量降到最低，第13 天突然升高，后降低。在排毒過程中，咽拭子排毒量要高于泄殖腔棉拭子，但差異不顯著(P>0.05)。

圖1　JN1株和其他AIV毒株HA、NA的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig 1　Phylogenic trees of the individual genes HA and NA of JN1 strain and other AIV

圖2　JN1株和其他AIV毒株P(guān)B2、PB1的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig 2　Phylogenic trees of the individual genes PB2 and PB1 of JN1 strain and other AIV

圖3　JN1株和其他AIV毒株P(guān)A、NP的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig 3　Phylogenic trees of the individual genes PA and NP of JN1 strain and other AIV

縱坐標(biāo)為每微克總RNA中病毒拷貝數(shù)，其中病毒拷貝數(shù)以log10為單位進(jìn)行表示圖5　AIV病毒在試驗鴨泄殖腔棉拭子與咽拭子中的排毒規(guī)律Fig 5　Results of AIV excretion in cloaca and pharynx after inoculation

3.5攻毒樣品血清抗體水平檢測試驗攻毒前對3周齡的雛鴨采血取血清進(jìn)行HI試驗，結(jié)果為陰性。攻毒感染后21 d內(nèi)觀察雛鴨，攻毒組的雛鴨精神狀態(tài)良好，食欲正常，無死亡情況和無明顯的發(fā)病癥狀。攻毒后 7 d、11 d、14 d、17 d、20 d，采血取血清進(jìn)行HI 試驗結(jié)果顯示，雛鴨接種JN1株之后7～17 d抗體效價緩慢上升，但抗體效價一直維持在較低水平(圖6)。

圖6　抗體檢測結(jié)果Fig 6　The result of antibody test

4　討　論

研究發(fā)現(xiàn)，鴨源H9N2亞型AIV血凝素裂解位點(diǎn)氨基酸序列特征與分離地區(qū)密切相關(guān)，中國大陸地區(qū)歐亞種系的鴨源H9N2亞型AIV裂解位點(diǎn)為-RSSR↓GL-，其他國家和地區(qū)分離的鴨源H9N2亞型AIV不具備這一特征[14]。從血凝素第226位受體結(jié)合位點(diǎn)看，中國鴨源H9N2亞型AIV有相當(dāng)一部分為L，具有同哺乳物唾液酸α-2，6 受體結(jié)合的特性[15]。通過對JN1株AIV HA蛋白潛在的糖基化位點(diǎn)分析表明缺少了218～220位和551～553位的糖基化位點(diǎn)，而在313～315增加了一個潛在的糖基化位點(diǎn)，新增糖基化位點(diǎn)的出現(xiàn)可能改變病毒的抗原性并影響受體結(jié)合特性而感染新的宿主[13-14]。

Liu等[16]報道我國近年來H9N2亞型AIV NA基因頸部第63、64、65位點(diǎn)上有3個氨基酸(T、E、I)連續(xù)缺失，而與中國鄰近的韓國、巴基斯坦雞源H9N2亞型AIV分離株NA沒有類似的氨基酸丟失[17]，該缺失被認(rèn)為是我國H9N2亞型AIV的一個分子標(biāo)簽，有報道此缺失可增強(qiáng)致病性[18]。試驗中的JN1株，符合上述特征。

M基因的編碼區(qū)由兩部分組成，分別編碼M1蛋白和M2蛋白。M2蛋白27位V，30位A，尤其是31位S的變異在對離子通道阻斷劑(金剛烷胺和金剛乙胺)產(chǎn)生抗性方面發(fā)揮著重要作用[19]。JN1株在31位S上發(fā)生了N的取代，說明這些病毒對金剛烷胺產(chǎn)生了耐藥性，應(yīng)該引起高度重視。

JN1株NS1基因第92位氨基酸為D，Seo等[20]研究發(fā)現(xiàn)NS1蛋白的第92位氨基酸為D時，毒株通常具有低致病，但是氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其149位氨基酸為A，而不是V，具有與高致病性AIV相關(guān)的NS 基因特征。同時，在對NS基因序列進(jìn)行核酸進(jìn)化分析時發(fā)現(xiàn)，NS基因與H5N1亞型AIV基因同源率高達(dá)99%，而和H9N2亞型AIV的同源率最高僅在94.6%，這說明JN1株NS基因很有可能是從H5N1亞型AIV傳播而來。

H9亞型AIV在鴨中很少引起發(fā)病，但研究結(jié)果表明，水禽尤其是鴨，是流感病毒的貯存庫，對AIV的發(fā)生及傳播起到了非常重要的作用。本試驗利用分離到的鴨源H9N2亞型AIV(JN1株)人工感染3周齡雛鴨，研究結(jié)果表明，H9N2亞型AIV在感染后第2～21天均有排毒，在感染后第3天達(dá)到排毒高峰，之后在第13天出現(xiàn)第2個排毒高峰，咽拭子和泄殖腔棉拭子規(guī)律一致。王蛟等[21]在對H9N2亞型AIV對櫻桃谷鴨致病性的研究中，得出經(jīng)滴鼻攻毒的雛鴨在攻毒后第4天到達(dá)排毒高峰，在第10天檢測不到病毒；魏寶芝等[22]對H9N2亞型AIV進(jìn)行氣源性傳播特點(diǎn)的研究中，第4天開始排毒，第6天排毒量最高，到第14天檢測不到病毒。試驗中在攻毒后第11天排毒量檢測結(jié)果接近陰性，在第13天出現(xiàn)第2個排毒高峰，推測原因是在試驗過程中存在再感染的存在。血清HI抗體效價結(jié)果顯示，雛鴨感染后血清效價一直維持在較低的水平。Kida等[23]曾報道，在感染流感和免疫流感過程中，鴨產(chǎn)生的抗體效價低，維持時間短，并且可以在短時間內(nèi)感染同一種亞型的流感病毒。

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