維藥野西瓜醇提物的鎮(zhèn)痛作用研究

黃先菊，柯才華，李　梅，陳　慧，袁　琳，*

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074；2 中南民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)與實(shí)驗(yàn)室管理中心，武漢 430074)

野西瓜(CapparisspinosaL.)為白花菜科山柑屬植物，又名槌果藤、老鼠瓜、刺山柑，在我國(guó)主要分布于新疆、甘肅和西藏等地，在國(guó)外分布于環(huán)地中海及西亞的一些國(guó)家[1]. 野西瓜是維吾爾醫(yī)常用藥材，具有清除體內(nèi)異常體液、暢通阻滯等功效.維藥野西瓜其根、果、葉均能入藥，功能祛風(fēng)除濕，止痛消腫[2,3]. 應(yīng)用多種炎癥模型對(duì)其醇提物抗炎鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，并初步探討了其作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步開發(fā)野西瓜在抗類風(fēng)濕新藥研究上提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1　材料與儀器

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠(18～22 g) ;購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0005. 飼養(yǎng)于中南民族大學(xué)藥學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房，嚴(yán)格按照《湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行，動(dòng)物房溫度為 (22±2) ℃，光照或黑暗條件下讓老鼠自由進(jìn)食. 為避免食物干擾，動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前12 h停止喂食，只供水.

1.2　藥材與試劑

野西瓜果系購于新疆的藥材干品，經(jīng)鑒定為白花菜科山柑屬植物野西瓜的果實(shí). 阿司匹林泡騰片(中國(guó)阿斯利康制藥有限公司)，嗎啡注射液(中國(guó)東北制藥集團(tuán))，冰醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為分析純.

1.3　主要儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司)，循環(huán)水多用真空泵、水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司)，高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，精密天平(梅特勒-托利多儀器公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo公司).

2　方法

2.1　野西瓜醇提物制備

野西瓜經(jīng)過干燥后打碎成粉狀，稱取適量，放入圓底燒瓶中加入足量95%乙醇進(jìn)行提取，回流提取3次，抽濾，合并濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以低溫 (45 ℃) 旋轉(zhuǎn)蒸干，制得野西瓜浸膏. 實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水溶解至所需濃度.

2.2　熱板法實(shí)驗(yàn)

按文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行熱板實(shí)驗(yàn)，選取痛閾值在5～30 s內(nèi)的SPF級(jí)小鼠40只，分別為空白組、3組劑量組(50、100、200 mg/kg)和嗎啡陽性對(duì)照組. 陽性對(duì)照組給予10 mg/kg的嗎啡，空白組給予等體積蒸餾水，給藥體積按5 mL/kg計(jì)算. 腹腔給藥40 min后再次測(cè)定小鼠的痛閾值. 計(jì)算最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)，公式為：MPE % =(給藥后痛閾時(shí)間-基礎(chǔ)痛閾時(shí)間)/(60-基礎(chǔ)痛閾時(shí)間)×100%.

2.3　冰醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

取小鼠40只，雌雄各半，同2.2方法分為5組，陽性對(duì)照組給予200 mg/kg的阿司匹林溶液，空白組給予等體積蒸餾水，給藥體積按5 mL/kg計(jì)算. 給藥40 min后各組腹腔注射0.6%的冰醋酸溶液，給藥劑量10 mL/kg. 注射完畢，立即記錄小鼠20 min內(nèi)扭體反應(yīng)的次數(shù)，腹部肌肉收縮同時(shí)后腿伸展記為一次扭體.

2.4　福爾馬林所致小鼠疼痛實(shí)驗(yàn)

取小鼠40只，雌雄各半，同2.2方法分為5組. 陽性對(duì)照組給予200 mg/kg的阿司匹林溶液，空白組給予等體積蒸餾水，給藥體積按5 mL/kg計(jì)算. 各組給藥1 h后，小鼠右后足底注射5%福爾馬林 (10 μL/只). 以秒表記錄小鼠注射后 0～5 min和 15～30 min累計(jì)舔后足的時(shí)間，作為1相和2相疼痛強(qiáng)度的指示信號(hào). 1相 (0～5 min) 和2相(15～30) min分別代表小鼠的神經(jīng)性和炎癥性疼痛反應(yīng)[5-7].

2.5　前列腺素E2含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)

福爾馬林實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，在踝關(guān)節(jié)以上0.5 cm處剪下致炎腫脹后足，稱取左右兩足重量，計(jì)算差值. 然后將剪下的后足絞碎，5 mL生理鹽水浸泡1 h，3000 r/min離心5 min，吸取上清液0.1 mL，加入0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液2 mL，50 ℃異構(gòu)化20 min，用甲醇稀釋至20 mL，在波長(zhǎng)278 nm處測(cè)吸光度，以每克炎性組織相當(dāng)?shù)腛D值表示前列腺素E2(PGE2)的含量.

2.6　NO濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)

將密度為2×106個(gè)/mL的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的懸液均勻接種于96孔板中，每孔100 μL，待細(xì)胞貼壁后(約2 h)，加入不同濃度野西瓜醇提物 (50、100、200 Mg/mL) 和LPS 1 μg/mL各100 μL，并設(shè)LPS模型組和空白對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，37 ℃預(yù)處理48 h后，取培養(yǎng)液上清按50 μL/孔加入96孔板中，室溫下，再在各孔中加入Griess Reagent Ⅰ和Griess Reagent Ⅱ，以含10%小牛血清的DMEM加顯色劑為空白對(duì)照組，標(biāo)準(zhǔn)品為NaNO2，用含10%小牛血清的DMEM稀釋，濃度設(shè)定為1、2、5、10、20、40、60、100 μ mol/L，以酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在540 nm處的吸光度值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品各濃度所得OD值擬合NO反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為：y= 0.0234x+0.0452，y為NO濃度 (μmol/L)，x為標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值OD540，R= 0.9993，線性關(guān)系良好. 按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出待測(cè)樣本NO濃度.

2.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分析，采用ANOVA方法進(jìn)行組間差異比較.

3　結(jié)果

3.1　野西瓜醇提物對(duì)小鼠基礎(chǔ)痛閾值的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出(圖1)，3個(gè)劑量組的野西瓜均有較高的最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)，鎮(zhèn)痛效果明顯，與空白組相比有顯著性差異，50～200 mg/kg的野西瓜引起劑量依賴性鎮(zhèn)痛效應(yīng). 同時(shí)，3個(gè)劑量組與陽性對(duì)照組相比，也均具有顯著性差異, 空白組沒有表現(xiàn)出明顯鎮(zhèn)痛效應(yīng).

*p< 0.05，**p < 0.01，與空白組相比；# p<0.05,## p<0.01 ，與陽性對(duì)照組相比圖1　野西瓜對(duì)小鼠熱板實(shí)驗(yàn)的鎮(zhèn)痛作用Fig.1　Analgesic effect of Capparis spinosa L. on hot plate test in mice

3.2　野西瓜醇提取物對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響

扭體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示(表1)，3個(gè)劑量組的野西瓜均可不同程度抑制小鼠腹腔注射冰醋酸所致扭體反應(yīng).低劑量組野西瓜(50 mg/kg)抑制程度較低,但依然能夠顯著抑制小鼠腹腔注射冰醋酸所致扭體反應(yīng)(p<0.05)，200 mg/kg和100 mg/kg劑量組的鎮(zhèn)痛效應(yīng)較其他給藥組更加顯著.

表1 野西瓜對(duì)醋酸所致扭體反應(yīng)作用Tab. 1　Effect of Capparis spinosa L. on writhing induced by ethylic acid

*p<0.05，**p<0.01，與對(duì)照組比較；#p<0.05，與陽性對(duì)照組比較

3.3　野西瓜醇提物對(duì)福爾馬林致痛小鼠作用及前列腺素E2釋放的影響

野西瓜50～200 mg/kg 對(duì)福爾馬林所致小鼠雙相疼痛(神經(jīng)性疼痛和炎癥性疼痛)反應(yīng)均呈劑量依賴性的抑制作用(表2). 其對(duì)2相炎癥性疼痛的鎮(zhèn)痛效果比1相更加明顯. 同陽性對(duì)照組阿司匹林組相比，200 mg/kg劑量組的野西瓜可以降低左右足的重量差，表明野西瓜具有一定抗炎作用.低劑量組50 mg/kg和100 m/kg對(duì)1相疼痛沒有明顯的抑制作用(p>0.05)，但對(duì)2相疼痛有明顯的抑制作用.

表2　野西瓜對(duì)小鼠注射福爾馬林后1相和2相的鎮(zhèn)痛作用

*p<0.05，**p<0.01；與對(duì)照組比較

##p<0.01，與模型組比較圖2　野西瓜對(duì)小鼠注射福爾馬林后足PGE2釋放的抑制作用 Fig.2　Inhibitory effect of Capparis spinosa L. on the release of PGE2 in mice after formalin injection

圖2 顯示，與空白對(duì)照組相比，注射福爾馬林組的小鼠后爪中PGE2含量明顯增加.阿司匹林 陽性對(duì)照組及劑量組50～200 mg/kg均能抑制PGE2釋放，表明野西瓜的抗炎作用是通過抑制環(huán)氧化酶-2(COX-2)的活性實(shí)現(xiàn).

3.4　野西瓜醇提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞NO釋放的影響

由圖3可見，1 μg/mL的LPS作用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞48 h后，能引起細(xì)胞NO分泌增加(p <0.01)，100、200 μg/mL濃度的野西瓜均能抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO的釋放(p<0.01).

**p<0.01，與對(duì)照組比較；## p<0.01，與LPS組比較圖3　野西瓜對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO的影響 Tab.3　Effect of Capparis spinosa L. on NO release induction by LPS in RAW264.7

4　討論

從熱板實(shí)驗(yàn)、冰醋酸扭體實(shí)驗(yàn)以及福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)中觀察到，小鼠給藥后痛閾時(shí)間較基礎(chǔ)痛閾時(shí)間顯著延長(zhǎng)，扭體次數(shù)明顯下降. 福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)給藥組中1相和2相小鼠舔后足的時(shí)間均較空白對(duì)照組明顯減少，表明野西瓜對(duì)中樞及外周性的疼痛都具有良好的鎮(zhèn)痛效果.

PGE2是前列腺素(PG)的一種，當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受到損傷或機(jī)械、物理或化學(xué)刺激時(shí)，可經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)生成PGE2. COX是PGE2合成過程中重要的限速酶，人體內(nèi)有兩種不同的COX同工酶，即COX-1和COX-2. 普遍認(rèn)為，COX-1是體內(nèi)正常的生理性酶，能夠調(diào)節(jié)組織器官內(nèi)生理性的PG；而COX-2則是一種經(jīng)過誘導(dǎo)后產(chǎn)生的誘導(dǎo)或病理性酶，可在炎癥部位催化炎性的PG合成并能誘發(fā)炎癥反應(yīng). Siegle等[8]發(fā)現(xiàn)在各類關(guān)節(jié)炎中，COX-2有不同程度的增高，而COX-1則無明顯變化，說明主要是COX-2促使PG合成增加，進(jìn)而引起了炎癥反應(yīng)的放大和增強(qiáng). 注射福爾馬林組的小鼠后爪中PGE2含量明顯增加,而3個(gè)劑量組的野西瓜能有效抑制PGE2釋放，說明野西瓜是通過抑制環(huán)氧化酶-2(COX-2)的活性實(shí)現(xiàn).

在各種炎性疾病病理過程中，NO起著重要的作用.適量的NO有助于減輕炎性反應(yīng)、殺滅病原微生物，但巨噬細(xì)胞在炎性或免疫性刺激下能夠產(chǎn)生大量的NO，這些NO能夠與超氧陰離子等氧自由基發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而增加其對(duì)組織細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒效應(yīng). Griess法結(jié)果顯示野西瓜能夠抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)NO的產(chǎn)生，使NO不能在細(xì)胞內(nèi)過度釋放，從而減輕細(xì)胞毒作用.

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步明確野西瓜具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，為其開發(fā)成為抗炎鎮(zhèn)痛類新藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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