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肺癌在全球腫瘤相關(guān)死亡原因中占據(jù)首位,是我國(guó)第4大主要死亡原因,其發(fā)病率和死亡率均高,并呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)2016年國(guó)際癌癥研究中心報(bào)告顯示,在2012年全球由于肺癌造成的死亡人數(shù)達(dá)160萬(wàn)人,占惡性腫瘤死亡病例的19%。肺癌種類較多,小細(xì)胞肺癌 (small cell lung cancer, SCLC)屬于其中一種,占肺癌總比例15%~18%,侵襲性強(qiáng),惡性程度高,對(duì)化療最敏感[1]。研究學(xué)者發(fā)現(xiàn),旋毛蟲(T.spiralis)具有抑制腫瘤作用,且有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,旋毛蟲感染可以體內(nèi)抵抗腫瘤[2]。旋毛蟲排泄分泌產(chǎn)物通過激活機(jī)體的固有免疫細(xì)胞、 產(chǎn)生細(xì)胞因子或腫瘤相關(guān)活性物質(zhì),從而可以體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[3],因此為腫瘤生物治療的研究提供了一個(gè)方向[4]。旋毛蟲生活史包括3個(gè)階段,成蟲、新生幼蟲和肌幼蟲,其中肌幼蟲寄生在宿主肌肉組織內(nèi)。在旋毛蟲感染過程中肌幼蟲較成蟲和新生幼蟲易獲取,羅婧梅[5]等實(shí)驗(yàn)表明,旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白(ESP)有抗腫瘤活性物質(zhì),而旋毛蟲蟲體蛋白是否對(duì)小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的增殖有抑制作用,以及是否誘導(dǎo)其凋亡,為本實(shí)驗(yàn)的研究目的。
1.1旋毛蟲、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)所用旋毛蟲為河南豬源旋毛蟲,由本實(shí)驗(yàn)室小鼠保種。6周齡健康小鼠,清潔級(jí),雌性昆明小鼠,體重20-25 g,購(gòu)自本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。H446細(xì)胞株購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司。
1.2旋毛蟲肌幼蟲的收集和蟲體蛋白的制備昆明小鼠經(jīng)口感染300條肌幼蟲45 d后頸椎離斷處死。參照文獻(xiàn)[6]的方法收集純凈的旋毛蟲肌幼蟲。肌幼蟲用含500 U/mL青鏈霉素的無(wú)菌生理鹽水反復(fù)清洗3次,將蟲體于4 ℃和-20 ℃反復(fù)凍存5次,用勻漿器冰上研磨蟲體30 min,鏡下觀察蟲體徹底分離斷開即可,收集研磨后的液體于4 ℃過夜,12 000 r/min、4 ℃離心30 min,取上清即為蟲體蛋白,0.22 μm濾器過濾后分裝,-80 ℃保存。
1.3H446細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代將于-80 ℃冰箱保存的H446細(xì)胞取出,迅速放入37 ℃水中快速搖晃直至完全溶解,再放入普通離心機(jī)以1 000 r/min速度離心 3 min,棄掉凍存液。加入1 mL配好的含10%血清和1%青鏈霉素混合液的RPMI1640培養(yǎng)基,重懸細(xì)胞后移入培養(yǎng)皿中放入37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每2 d更換含血清的RPMI1640培養(yǎng)基,待細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)皿的70%~80%,即可用含0.25%胰酶消化細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞傳代,3次傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞待用。
1.4MTT法檢測(cè)H446細(xì)胞增殖抑制率收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H446細(xì)胞,調(diào)整為8×104/mL的細(xì)胞密度,按每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板,于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,實(shí)驗(yàn)組蟲體蛋白濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的RPMI1640培養(yǎng)基,陰性對(duì)照組更換為不含蟲體蛋白的RPMI1640培養(yǎng)基,每孔200 μL,每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入20 μL MTT(5 mg/mL),37 ℃培養(yǎng)4 h后棄掉培養(yǎng)基,加入150 μL DMSO,振板10 min,通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A490值)的OD值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次,計(jì)算抑制率和半數(shù)抑制率(IC50)的濃度。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值)×100%。
1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H446細(xì)胞凋亡率收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H446細(xì)胞,取1×106/mL的細(xì)胞密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中,過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后棄掉培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組用含 0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL蟲體蛋白的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,同時(shí)設(shè)立不含蟲體蛋白的RPMI1640培養(yǎng)基的陰性對(duì)照組。蟲體蛋白作用24 h后收集H446細(xì)胞并計(jì)數(shù),用1×Buffer調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL,每組各取100 μL細(xì)胞放入流式BD管,加入5 μL Annexin V FITC和5 μL PI染色抗體,室溫避光孵育15 min,補(bǔ)加400 μL Buffer,過300鉬尼龍網(wǎng)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
1.6Real-timePCR檢測(cè)Cyt-C、Apaf-1 mRNA表達(dá)情況將對(duì)數(shù)期H446細(xì)胞接種到6孔板,CO2培養(yǎng)箱孵育過夜貼壁,實(shí)驗(yàn)組分別加入0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL蟲體蛋白,陰性對(duì)照組加入不含血清1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后按TRIzol 試劑說明書提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度儀檢測(cè)RNA的濃度。依照TAKARA RT-PCR試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取1 μg 總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 反應(yīng)條件為:37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min,95 ℃ 5 s,4 ℃。后續(xù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,退火60 s。引物序列見表1。
表1Cyt-C、Apaf-1、GAPDH引物序列
Tab.1Primer sequence of Cyt-C, Apaf-1 and GAPDH
基因名稱Genename序列Sequence擴(kuò)增片段長(zhǎng)度/bpAmplifiedfragmentlengthCyt?C上游引物5′?ACACCTGACCAGAAACTTTGTCTCC?3′下游引物5′?GCCAAAGCAGCAGCTCAGTATGTA?3′79Apaf?1上游引物5′?GCCAGTGCCAAGATGCACA?3′下游引物5′?ATCAGATGAGCAGGGCCTACAAG?3′95GADPPH上游引物5′?GCACCGTCAAGGCTGAGAAC?3′下游引物5′?TGGTGAAGACGCCAGTGGA?3′138
1.7Western blot檢測(cè)Cyt-C、Apaf-1蛋白表達(dá)情況將對(duì)數(shù)期H446傳代到100 mm培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞長(zhǎng)到70%~80%,實(shí)驗(yàn)組分別加入0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL蟲體蛋白,陰性對(duì)照組加入不含血清1640培養(yǎng)基,作用24 h后按細(xì)胞裂解液說明書提取細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。每孔加樣100 μg,電壓80 V轉(zhuǎn)120 V進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),穩(wěn)流冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,5%脫脂奶粉封閉3 h,室溫下與兔抗人Cyt-C、Apaf-1、β-actin單克隆抗體分別孵育2 h后,4 ℃過夜。TBST洗膜3次,每次10 min,二抗室溫孵育1.5 h。TBST洗膜3次,每次10 min。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL) 試劑盒按照說明進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用Quntity One 4.62 軟件對(duì)蛋白質(zhì)印跡條帶進(jìn)行定量分析。
2.1MTT對(duì)H446細(xì)胞增殖抑制率MTT結(jié)果顯示,蟲體蛋白對(duì)H446細(xì)胞有明顯的抑制作用,并隨著劑量增大和時(shí)間的延長(zhǎng),蟲體蛋白對(duì)H446細(xì)胞的抑制作用也在增加,呈現(xiàn)出劑量-時(shí)間依賴性,見表2。
2.2流式細(xì)胞術(shù)誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),蟲體蛋白作用于H446細(xì)胞24 h后,實(shí)驗(yàn)組濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL的蟲體蛋白凋亡率高于對(duì)照組(P<0.05)見表3,圖1。
2.3Real-time PCR及Western blot檢測(cè)Cyt-C、Apaf-1 mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組Cyt-C、Apaf-1 mRNA和蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組(圖2、圖3)。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,均有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。
蟲體蛋白濃度Polypideproteinconcentration(mg/mL)24h48h72h0.26.5±5.37?8.1±5.67?10.9±6.74?0.411.83±4.56?14.3±3.3?15.6±1.15?0.619.8±4.84?28.1±1.61?43.36±2.87?0.833.03±1.87?39.87±6.15?54.97±7.97?1.037.03±3.3?56.83±3.58?71.97±5.25?1.249.26±1.3?70.13±6.85?85.07±5.89?
注:P<0.05。
組別Group凋亡率ApoptosisrateControl6.49±1.120.2mg/mL14.67±0.47?0.4mg/mL20.32±1.28?0.6mg/mL25.1±2.98?
注:P<0.05。
A為對(duì)照組,B為0.2 mg/mL蟲體蛋白組,C為0.4 mg/mL蟲體蛋白組,D為0.6 mg/mL蟲體蛋白組A is control group, B is 0.2 mg/mL somatic protein group, C is 0.4 mg/mL somatic protein group, and D is 0.6 mg/mL somatic protein group 圖1 蟲體蛋白誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡Fig.1 Somatic proteins induced apoptosis on H446 cell
圖2 Cyt-C和Apaf-1 mRNA表達(dá)Fig.2 mRNA expression of Cyt-C and Apaf-1
表4各組Cyt-C和Apaf-1與對(duì)照組相比的結(jié)果
Tab.4Results of Cyt-C and Apaf-1 in each group conpare with the contrd group
組別GroupCyt?CApaf?1control110.4mg/mL1.37±0.14?1.43±0.1?o.6mg/mL1.47±0.12?1.52±0.12?0.8mg/mL1.85±0.33?1.95±0.33?
注:*P<0.05。
圖3 Cyt、Apaf-1、Actin蛋白表達(dá)Fig.3 The protein expression of Cyt-C, Apaf-1 and Actin
腫瘤生物制劑的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn),天然抗腫瘤活性物質(zhì)存在于多種生物中,如喜樹堿、鬼臼毒素、苔蘚蟲素-1、苦參堿等天然抗腫瘤藥物[7],此外一些寄生蟲如棘阿米巴滋養(yǎng)體[8]、瘧原蟲[9]、旋毛蟲[10]也發(fā)現(xiàn)對(duì)多種腫瘤有抵抗作用。旋毛蟲蟲體感染或其分泌物、提取物與抑制腫瘤的研究越來越多。旋毛蟲的生活史經(jīng)歷成蟲、新生幼蟲和肌幼蟲3個(gè)階段,成蟲寄生于宿主的小腸,產(chǎn)出新生幼蟲,研究表明,旋毛蟲的成蟲和新生幼蟲有抑制腫瘤增殖的作用[11],但是成蟲和新生幼蟲在腸道生活時(shí)間較短,不易獲得,旋毛蟲肌幼蟲寄生于肌肉組織中,較成蟲和新生幼蟲更易獲取。Luo JM[12]等研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白(ESPs)能夠通過線粒體凋亡通路誘導(dǎo)H446腫瘤細(xì)胞的凋亡。劉箐等[13]以BALB/c裸鼠右側(cè)腋下注射人肝癌H7402細(xì)胞為研究對(duì)象,探討旋毛蟲A200711蛋白對(duì)BALB/c裸鼠皮下人肝H7402細(xì)胞實(shí)體瘤的抑制作用, 建立裸鼠實(shí)體瘤模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射A200711蛋白的對(duì)照組12d后裸鼠實(shí)體瘤體積明顯縮小,抑瘤率達(dá)到 39.67%,證實(shí)了旋毛蟲蟲體蛋白A200711可調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)選用旋毛蟲肌幼蟲蟲體蛋白作為研究對(duì)象,應(yīng)用MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),結(jié)果表明旋毛蟲肌幼蟲蟲體蛋白對(duì)小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞增殖有抑制作用,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,Cyt-C和Apaf-1高表達(dá)。
Cyt-C是線粒體中第一個(gè)被鑒定出在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的細(xì)胞凋亡因子[14]。線粒體受損之后導(dǎo)致Cyt-C釋放,Cyt-C從線粒體釋放到胞質(zhì)中,并且與Apaf-1結(jié)合,聚集ProCaspase-9,形成Cyt-C,Apaf-1,ProCaspase-9三者的復(fù)合物,即“凋亡復(fù)合體”,導(dǎo)致Caspase-3活化切割底物使細(xì)胞凋亡。其中,Cyt-C是唯一能啟動(dòng)Apaf-1的凋亡分子,發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[15]。Apaf-1是線粒體凋亡途徑中的一個(gè)促凋亡因子,是重要的腫瘤抑制基因,是凋亡復(fù)合體的核心,在凋亡復(fù)合體的形成過程中起關(guān)鍵作用,其表達(dá)升高可恢復(fù)腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性[16]。Apaf-1作為線粒體凋亡途徑中的核心組成部分,它的變化與細(xì)胞凋亡的程度呈正相關(guān)。
本實(shí)驗(yàn)中線粒體凋亡因子Cyt-C、Apaf-1高表達(dá),考慮旋毛蟲肌幼蟲蟲體蛋白可能會(huì)通過線粒體內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)H446細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果為尋找抗腫瘤藥物提供了新設(shè)想,為腫瘤生物治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
參考文獻(xiàn):
[1] Planchard D, Le PC. Small cell lung cancer: new clinical recommendations and current status of biomarker assessment[J]. Euro J Cancer, 2011, 47(Suppl 3): S272-283. DOI: 10.1016/S0959-8049(11)70173-3
[2] Gong PT, Zhang JZ, Cao LL, et al. Identification and characterization of myeloma-associated antigens inTrichinellaspiralis[J]. Exper Parasitol, 2011, 127(4): 784-788. DOI: 10.1016/j.exppara.2010.12.001
[3] Duan LX, Li JH, Cheng BQ, et al. Identification of a novel gene product expressed byTrichinellaspiralis, that binds antiserum to Sp2/0 myeloma cells[J]. Vet Parasitol, 2013, 194(2/4): 183-185. DOI: 10.1016/j.vetpar.2013.01.051
[4] Duan LX, Guan XM, Zhang CS, et al. Research progress on anti-tumor mechanism ofTrichinellaspiralis[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis Feb, 2011, 29(2): 142-146. DOI: 1000-7423(2011)-02-0142-05 (in Chinese)
段玲欣,關(guān)學(xué)敏,張傳生,等.旋毛蟲抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2011,29(2):142-146.
[5] Luo JM, Cheng LY, Guan XD, et al. LC-MS/MS Analsis on the compoent of excretory-secretory protein oftrchinellaspiralismuscle larvae[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2016, 34(1): 53-57. DOI: 1000-7423(2016)-01-0053-05 (in Chinese)
羅婧梅,程露陽(yáng),關(guān)曉東,等.質(zhì)譜法分析旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白的組分[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2016,34(1):53-57.
[6] Wang GY,Ma YF, Liu GC, et al. Immune protective effect of excretroy-secretory antifen fromTrichinellaspiralis[J]. Immunological J, 2007, 23(5): 586-587. (in Chinese)
王國(guó)英,馬遠(yuǎn)方,劉廣超,等.兩種方法制備的旋毛蟲ES抗原對(duì)小鼠免疫保護(hù)作用研究[J].免疫學(xué)雜志,2007,23(5):586-587.
[7] Zhang J, Yang L, Gao WY, et al. Advances in studies on natural antitumor drugs[J]. Chin Traditional Herbal Drugs,2010, 41(6): 1014-1020. (in Chinese)
張靖,楊柳,高文遠(yuǎn),等.天然抗腫瘤藥物研究進(jìn)展[J].中草藥,2010,41(6):1014-1020.
[8] Qian M, Yan Z, Zhang P, et al. Toxic effect ofacanthamoebaon melanoma cell[J]. Acta Parasitol Med Entomol Sin, 2003, 10(2): 65-69. DOI:10.3969/j.issn.1005-0507.2003.02.001 (in Chinese)
錢旻,嚴(yán)正,章平,等.棘阿米巴對(duì)黑色素瘤細(xì)胞毒性作用初探[J].寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào),2003,10(2):65-69.
[9] Quan L, Ying JY, Xue FX, et al.Plasmodiumparasite as an effective hepatocellular carcinoma antigen glypican-3 delivery vector[J]. Oncotarget, 2017, 8(15): 24785-24796. DOI: 10.18632/oncotarget.15806
[10] Wang XL, Fu BQ, Yang SJ, et al.Trichinellaspiralis-a potential anti-tumor agent[J]. Vet Parasitol, 2009, 159(4): 249-252.
[11] Wang XL, Yang SJ,Wu XP, et al. Inhibitory effect ofTrichinellaspiralispolypide protein on hepatic cancer cells H7402[J]. Chin J Cancer Biother, 2007, 14(5): 440-444. DOI:10.3872/j.issn.1007-385X.2007.5.139(in Chinese)
王學(xué)林,楊世杰,吳秀萍,等.旋毛蟲蟲體蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞H7402的抑制作用[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2007,14(5):440-444.
[12] Luo JM, Yu L, Xie GC, et al. Study on the mitochondrial apoptosis pathways of small cell lung cancer H446 cells induced byTrichinellaspiralismuscle larvae ESPs[J]. Parasitology, 2017:793-800. DOI: 10.1017/S0031182016002535
[13] Liu J, Liu XL, Bai X, et al.Inhibitory effect of the A200711 protein fromTrichinellaspiralison BALB/c nude mice bearing H7402 soid tumor[J].Chin J Vet Sci, 2015, 35(9): 1483-1487. (in Chinese)
劉菁,劉曉雷,白雪,等.旋毛蟲A200711蛋白對(duì)裸鼠H7402細(xì)胞實(shí)體瘤的抑制作用[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015,35(9):1483-1487.
[14] Koty PP, Tyurina YY, Tyurin VA, et al. Depletion of Bcl-2 by an antisense oligonucleotide induces apoptosis accompanied by oxidation and externalization of phosphatidylserine in NCI-H226 lung carcinoma cells[J]. Mol Cellular Biochem, 2002, 234-235(1): 125-133. DOI: 10.1023/A:1015932615769
[15] Yu X, Wang L, Acehan D, et al. Three-dimensional structure of a double apoptosome formed by the Drosophila, Apaf-1 related killer[J]. J Mol Biol, 2006, 355(3): 577-589. DOI: 10.1016/j.mb.2005.10.040
[16] Kasai H, Yamamoto K, Koseki T, et al. Involvement of caspase activation through release of cytochrome c from mitochondria in apoptotic cell death of macrophages infected withActinobacillusactinomycetemcomitans[J]. Fems Microbiol Lett, 2004, 233(1): 29-35. DOI: 10.1016/j.femsle,2004.01.034