細粒棘球蚴特異性診斷抗原Eg-07279的制備及免疫原性研究

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細粒棘球蚴病又稱包蟲病(echinococcosis)，是由細粒棘球絳蟲的蚴蟲寄生于人體及一些哺乳動物體內(nèi)所致的人獸共患寄生蟲疾病，其中95%以上為囊型包蟲病(cystisechinococcusis,CE)[1]。我國將其列為二類動物疫病，世界動物衛(wèi)生組織將其列為B類動物疾病[2]。該病成世界性分布，我國是包蟲病發(fā)病率最高的國家之一，人群患病率為0.6%～4.5%, 在23個省區(qū)發(fā)現(xiàn)原發(fā)性病例，流行分布面積占全國總面積的44%[3-4]，主要分布于西部7省(新疆、甘肅、寧夏、青海、四川、內(nèi)蒙和西藏)，對人體健康產(chǎn)生一定的威脅，對經(jīng)濟發(fā)展產(chǎn)生較大阻礙，尤其以牧區(qū)和半牧區(qū)最為嚴重[5]。

細粒棘球蚴為雙宿主寄生，其在中間宿主人體內(nèi)的感染周期較長且過程復雜，包括蟲卵、六鉤蚴、原頭蚴等多個生長階段，中間宿主吞食蟲卵或孕節(jié)后引發(fā)感染，在肝或肺等器官形成包囊,對機體產(chǎn)生損傷[6]。然而，目前包蟲病治療的有效手段主要是臨床手術(shù)，若能在發(fā)病早期進行診斷可有效地降低對人體的損傷，因此找到病原體發(fā)育早期的特異性診斷抗原將可以有效地進行包蟲病早期診斷。本研究通過對細粒棘球絳蟲不同階段表達譜的差異分析，篩選出的優(yōu)勢診斷抗原分子Eg-07279，該分子能夠在棘球蚴原頭節(jié)中高表達而六鉤蚴階段不表達，可能成為具有高效診斷價值的診斷抗原候選分子。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自Promega公司(美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Revert Aid First strand cDNA Synthesis Kit)購自Thermo公司(美國)；重組蛋白純化試劑盒購自德國墨克公司；弗氏完全/不完全佐劑購自SIGMA公司(美國)；表達載體pET-28a由本實驗室保存。

1.1.2實驗動物購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心6～8周雌性Balb/c小鼠50只，體重18～20 g。

1.1.3原頭節(jié)來源于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院肝膽外科提供的包蟲病患者完整包囊，無菌分離原頭節(jié)。

1.1.4感染血清由本實驗室保存。

1.2方法

1.2.1篩選、合成抗原分子根據(jù)國家人類基因組南方研究中心(CHGC)公開發(fā)表的細粒棘球絳蟲的11 325個mRNA測序數(shù)據(jù)，分別對其原頭節(jié)階段和六鉤蚴階段基因的表達豐度RPKM值和飽和度reads進行比較，篩選出在棘球蚴的原頭節(jié)階段和囊壁階段高表達且reads > 20的片段，利用蛋白數(shù)據(jù)庫uniprot和Softberry Prediction軟件等對候選分子進行基因功能分析和亞細胞學定位，篩選出優(yōu)勢抗原分子Eg-07279并對其進行進一步探究、分析。

1.2.2表達載體的構(gòu)建及鑒定引物序列及內(nèi)切酶：CGAGCTCATGTCGTTTGATCACAGGAATATGGSacI：CCGCTCGAGTTAGAGTGCTTCAAAGAGATCAACAXhoI：用限制性內(nèi)切酶SacI 和XhoI分別對重組質(zhì)粒Eg-07279/pGEM-T和pET-28a在37 ℃雙酶切, 獲得目的片段和表達載體pET-28a，在T4連接酶的作用下4 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中，在含卡那霉素(終濃度為50 μg/mL)的LB平板培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜。選取單克隆，搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，以限制性內(nèi)切酶SacI 和XhoI雙酶切鑒定，并將重組菌送生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定。

1.2.3重組蛋白rEg-07279誘導表達與純化將重組菌株37 ℃振蕩培養(yǎng)至吸光度A=0.6時加入誘導劑IPTG 1 mmol/L誘導表達2 h， 6 000 r/min, 離心10 min，棄上清，收集細菌沉淀，用含有His-tag標簽的鎳柱在變性條件下分離純化重組蛋白。將該重組蛋白經(jīng)含尿素梯度濃度(6、4、2、0 mol/L)的PBS逐步透析復性, 并進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4特異性抗血清制備免疫動物：60只雌性BABL/c小鼠(18～20 g)隨機分為3組，見表1。

表1免疫動物分組
Tab.1Group of immunized animal

組別Group處理Treatment劑量Dosage空白組Blank不作處理100μL/只免疫組ImmunizationEg?07279+佐劑100μL/只免疫對照組ImmunizationControlPBS+佐劑100μL/只

采用皮下多點注射，初次免疫使用弗氏完全佐劑，2周后加強免疫使用弗氏不完全佐劑，均為100 μL/只(含重組蛋白10 μg)。分別于免疫前，首次免疫后1、2、4周每組小鼠尾靜脈采血，免疫后6周進行去眼球采血。血樣1 000 ×g離心10 min，取血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4小鼠血清中特異性IgG抗體檢測稀釋重組抗原rEg-07279 至終濃度為10 μg/mL，100 μL/孔包被ELISA板，PBST洗滌3次后，每孔150 μL 5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉，37 ℃孵育2 h，洗滌3次，每孔加入上述3組小鼠血清 100 μL(1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌3次，加入HRP-IgG山羊抗小鼠抗體100 μL(1∶5 000)，37 ℃孵育2 h；PBST洗滌3次后每孔加入可溶性TMB底物100 μL，室溫作用30 min，加入1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，用酶標儀檢測A450值。

1.2.5蛋白印跡法(Western blot)鑒定重組蛋白rEg-07279重組蛋白rEg-07279進行SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再以5% 脫脂奶粉4 ℃封閉12 h，以PBST洗滌。各硝酸纖維素膜分別以空白組小鼠血清(1∶200)、重組蛋白rEg-07279免疫組小鼠血清(1∶200)、原頭節(jié)繼發(fā)感染小鼠血清(1∶200)、室溫孵育2 h，PBST洗滌后再加入山羊抗鼠HRP-IgG抗體(1∶5 000)室溫孵育1 h，經(jīng)PBST洗滌后加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物顯色，5 min后，加ddH2O中止反應(yīng)，進行成像。

1.2.6重組蛋白rEg-07279人類血清學分析包被緩沖溶液稀釋重組蛋白rEg-07279后進行ELISA板包被，經(jīng)5%牛血清白蛋白(BSA)封閉后分別用10位健康人血清(1∶2 000稀釋)和10位病人血清(1∶2 000稀釋)進行識別，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌，再以辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗人總IgG抗體37 ℃孵育1 h，PBST洗滌后每孔加入可溶性TMB底物100 μL，室溫作用30 min，加入0.5 mol H2SO4終止反應(yīng)，于450 nm波長檢測其OD值。

1.3統(tǒng)計分析采用SPSS17.0與Graph Pad5.0進行統(tǒng)計學的相關(guān)分析。多組之間采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組間比較采用t檢驗。檢驗水平為α=0.05。

2　結(jié)　果

2.1生物信息學分析結(jié)果

2.1.1表達譜分析利用生物信息學差異分析比較細粒棘球絳蟲表達譜，經(jīng)篩選可得基因Eg-07279在六鉤蚴階段的飽和度(Reads)和表達豐度(RPKM)均為0，在原頭蚴階段飽和度值和表達豐度分別為28和161，囊壁中的飽和度值和表達豐度分別為47和190，即Eg-07279只在棘球蚴階段的原頭蚴和囊壁中表達，而在六鉤蚴中不表達，是編碼膜蛋白的基因，分子大小為1 890 bp，見表2。

2.1.2Eg-07279抗原表位預測分析通過軟件DNAStar對Eg-07279進行抗原表位預測分析， 選取其中抗原表位豐富的片段作為抗原分子的靶序列。結(jié)果見圖1顯示，抗原表位主要位于2-20，50-80， 185-235，315-334， 340-382，432-455，467-526，570-582等氨基酸殘基及其附近。

表2Eg-07279不同階段表達譜差異分析
Tab.2Eg-07279 differential expression profiling

GeneIDLength/bpAdultOncPSCCystReadsRPKMReadsRPKMReadsRPKMReadsRPKMEg?07279189049173002816147190

圖1　Eg-07279抗原表位預測分析Fig.1　Eg-07279 epitope prediction analysis

2.1.3Eg-07279同源性分析將該分子于NCBI(National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫做Blast比對，共有102條具有同源比對信息，從中選取E value =0且ident value相對較大的同源信息用MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件進行進化樹制作見圖2，分析比對其同源性。由結(jié)果可知Eg-07279與細粒棘球蚴、泡球蚴，多房棘球絳蟲的同源性均達100%。

圖2　Eg-07279同源性分析Fig.2　Eg-07279 homology analysis

2.1.4Eg-07279信號通路分析通過KEGG(京都基因與基因組百科全書，http://www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫進行比對分析，其匹配結(jié)果顯示該分子涉及多條信號通路，如JAK-STAT pathway、B/T cell receptor signaling pathway等，見圖3。這些代謝通路主要參與細胞的免疫調(diào)節(jié)以及增殖分化等生物學過程。

圖3　Eg-07279信號通路分析Fig.3　Eg-07279 signaling pathway analysis

2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定Eg-07279經(jīng)PCR擴增獲得目的片段約為1 890 bp，與預期片段大小相符，見圖4。經(jīng)測序，插入序列和CGHC所公布的該分子的序列基本一致，表明重組表達質(zhì)粒pet28a-Eg-07279構(gòu)建成功。

M:DNA標志物；1：重組質(zhì)粒pET28a-Eg-07279；2：重組質(zhì)粒pET28a-Eg-07279單酶切；3：重組質(zhì)粒pET28a-Eg-07279雙酶切；4：PCR產(chǎn)物M: DNA marker; 1: Recombinant plasmid pET28a-Eg-07279; 2: Recombinant plasmid digested by Sac I；3: Recombinant plasmid digested by Sac I and Xho I; 4: PCR product.圖4　重組質(zhì)粒pET28a-Eg-07279酶切鑒定結(jié)果Fig.4　Identification of pET28a-Eg-07279 by restriction enzyme

2.3重組蛋白rEg-07279純化及鑒定在最優(yōu)表達條件(37 ℃，6h，IPTG 1 mmol/L)下誘導表達重組rEg-07279蛋白，經(jīng)超聲破碎裂解及親和層析法進行純化，獲得包涵體重組蛋白rEG-07279，經(jīng)尿素梯度透析對其進行復性。完成復性的重組蛋白rEG-07279進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測重組蛋白rEg-07279大小為69 kD，見圖5，與目的蛋白一致。

M: 預染蛋白質(zhì)標志物 1: 未誘導陰性對照；2：誘導后全菌；3: 純化重組蛋白rEg-07279M: Protein marker； 1: Uninduced negative control; 2: Whole-cell lysate after induction；3: Purified rEg-07279 after dialysis.圖5　重組蛋白rEg-07279 SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.5　SDS-PAGE analysis of recombinant protein rEg-07279

2.4rEg-07279免疫小鼠后其血清中特異性IgG水平檢測經(jīng)檢測小鼠在重組抗原首次免疫2周后免疫組特異性IgG抗體水平開始升高，加強免疫后特異性IgG抗體水平顯著升高，第6周時達到最高(2.559±0.125)，與佐劑組(0.3640±0.005)和空白對照組(0.319 0±0.01)相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而佐劑組和空白對照組的IgG抗體水平隨時間變化不大，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖6。

(7)畸形攀比。寄宿生盲目攀比，特別是部分孩子家境條件較差，愛與同學比較，又總覺得自己底氣不足，于是怨天尤人，不思進取。

圖6　小鼠血清抗rEg-07279特異性IgG水平變化Fig.6　Kinetics of specific anti-rEg-07279 IgG in murine sera

2.5重組蛋白rEg-07279免疫原性分析重組蛋白rEg-07279分別與空白對照組小鼠血清、原頭蚴繼發(fā)感染鼠血清以及重組蛋白免疫組小鼠血清進行western blot檢測，結(jié)果顯示原頭蚴繼發(fā)感染組和重組蛋白免疫組血清均可與該重組蛋白識別，空白對照組鼠血清不能識別，見圖7。

M:蛋白標志物；1：空白對照組；2：原頭蚴繼發(fā)感染組；3：重組蛋白rEg-07279免疫組M: Protein marker； 1: Serum of the control mice；2: Serum of mice with secondary infection；3: Serum of the immunization group.圖7　重組蛋白rEg-07279 western blot分析 Fig.7　Western blot analysis of recombinant protein rEg-07279

2.6重組蛋白rEg-07279人血清學識別將重組蛋白rEg-07279包被ELISA板，分別以正常人(Control)的血清和包蟲病人(Patient)的血清進行血清學識別，結(jié)果顯示與正常人的檢測值相比，包蟲病人的IgG抗體水平表現(xiàn)出明顯差異，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖8。

圖8　重組蛋白rEg-07279 人類血清學識別Fig.8　Human serological identification of recombinant protein rEg-07279

3　討　論

細粒棘球蚴病具有人獸共患性，已被列為我國今后重點防控的寄生蟲疾病之一。它對人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展均會產(chǎn)生較大危害[7]。人體感染棘球蚴后產(chǎn)生包囊生長緩慢，一般發(fā)現(xiàn)患病時包囊已在肝臟或肺等器官里形成較大體積的占位，對人體相關(guān)組織和器官造成機械性或病理性損傷[8]。近年來，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，各地引進和飼養(yǎng)牲畜數(shù)目不斷增加，形成新的包蟲病污染區(qū)。在城市中，隨著皮毛制品的流通使用、寵物飼養(yǎng)數(shù)目的增多以及旅游業(yè)發(fā)展帶來的快速人口流動導致包蟲病向城市蔓延的危險性也不斷增加，近年來更多省區(qū)出現(xiàn)散在病例報告[9-10]。因此，細粒棘球蚴病不但是個特殊的醫(yī)學和獸醫(yī)學問題也是社會經(jīng)濟問題。

國內(nèi)目前針對人體棘球蚴患者，手術(shù)治療是主要手段，但是經(jīng)常伴有術(shù)后復發(fā)和繼發(fā)感染[11]。目前較為有效的藥物治療主要為甲苯咪唑、阿苯噠唑(又名丙硫咪唑)。但是這些手段都只能用于病灶發(fā)展成型期，此時已經(jīng)對患者造成了生理及心理的損傷。能夠準確判斷包蟲病發(fā)展的狀況，選擇合適的用藥時機，找到新的具有代表性的、針對性的、敏感性的、特異性高的、某個階段特有的抗原勢在必行。因此篩選包蟲病特異性診斷抗原，對包蟲病的防治有十分重要的作用和意義。

本研究通過對CHGC公開發(fā)表的細粒棘球絳蟲不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行差異分析，比較篩選出優(yōu)勢抗原分子Eg-07279，分子大小為1890 bp。通過對該分子在不同階段表達譜的分析發(fā)現(xiàn)其在原頭蚴階段高表達，其飽和度(Reads)值和表達豐度(RPKM)分別為28和161，而在六鉤蚴階段飽和度(Reads)和表達豐度(RPKM)均為0，是在棘球蚴階段特異性表達的分子。利用DNAStar分析軟件對Eg-07279進行抗原表位預測分析，預測結(jié)果顯示該分子具有豐富的抗原表位。經(jīng)進化樹分析比對，該分子與泡球蚴、多房棘球絳蟲有很高的同源性，結(jié)合KEGG信號通路分析知該分子與細胞免疫應(yīng)答、增值分裂等生物過程有關(guān)，有可能是寄生蟲發(fā)育階段必需分子?；诖耍狙芯繕?gòu)建了重組表達質(zhì)粒載體pET28a-Eg-07279，在大腸埃希菌中經(jīng)IPTG誘導表達獲得重組蛋白rEg-07279，該重組蛋白純化后用于免疫動物，免疫后實驗組和空白組小鼠進行血清學檢測，結(jié)果顯示2周后即可在動物血清中檢測到特異性IgG抗體，4周后特異性IgG水平出現(xiàn)明顯升高，第6周時達到最高(2.559 ± 0.125)，可見，該重組抗原可誘導小鼠產(chǎn)生特異性抗體，表現(xiàn)出良好的免疫原性。重組抗原rEg-07279原頭蚴Western blot檢測結(jié)果，重組抗原rEg-07279能夠特異性識別原頭蚴繼發(fā)感染的小鼠血清和該重組抗原免疫后的小鼠血清，而對空白組小鼠血清不識別，表明該重組蛋白具有較好的抗原性。

由上可知，重組抗原rEg-07279免疫動物后能夠在動物體內(nèi)產(chǎn)生較強烈的免疫反應(yīng)，說明重組抗原rEg-07279具有良好的抗原特性和免疫原性，有望成為細粒棘球蚴特異性診斷抗原分子。

參考文獻：

[1] Fan LC, Liao TX, Li H, et al. Dynamic of maternal antibody immunized with genetic engineering subunit vaccine of sheep hydatid disease [J]. China Herbivore Science, 2015, 35(5): 53-55. (in Chinese)

[2] McManus DP, Zhang WB, Li J, et al. Echinococcosis[J]. Lancet, 2003, 362(9392): 1295-1304. DOI: 016/S0140-6736(03)14573-4

[3] Budke CM, Peter D, Torgerson PR. Global socioeconomic impact of cystic Echinococcosis[J]. Emerg Infect Dis, 2006, 12(2): 296-303. DOI: 10.3201/eid1202.050499

[4] Jia WZ, Tian GF. Study on the prevention and treatment of hydatid disease [J]. Chin J Veter Parasitol, 1998, 6(4): 49-51. (in Chinese)

賈萬忠, 田廣孚. 棘球蚴病防治技術(shù)研究概況[J]. 中國獸醫(yī)寄生蟲病雜志, 1998, 6(4): 49-51.

[5] Cao DP, Fan HN, Wu DF, et al. Preliminary proteomics analysis on protoscoleces and cyst wall of human hydatid cyst [J]. Chin J Zoonoses, 2014, 30(6): 575-582. DOI:10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2014.06.006 (in Chinese)

曹得萍, 樊海寧, 毋德芳, 等. 細粒棘球絳蟲在人體內(nèi)棘球蚴原頭節(jié)、囊壁蛋白表達譜分析[J]. 中國人獸共患病學報, 2014, 30(6): 575-582.

[6] Zhao YQ, Li ZH, Wang H, et al. Cloning, expression and immungenicity analysis of antigenEg-01883 screened from protoscoleces ofEchinococcusgranulosus[J]. Chin J Parasitol Paras Dis, 2016, 3(34): 208-213. (in Chinese)

趙殷奇, 李子華, 王浩, 等. 細粒棘球絳蟲原頭節(jié)抗原分子Eg-01883的克隆、表達及免疫原性分析[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2016, 3(34): 208-213.

[7] Zhang W, Zhang Z, Wu W, et al. Epidemiology and control of Echinococcosis in central Asia, with particular reference to the People’s Republic of China[J]. Acta Tropica, 2015, 141(Part B): 235-243.4. DOI: 10.1016/j.actatropica.2014.03.014. DOI: 10.1016/B978-0-444-53490-3.00026-1

[8] Barnes TS, Deplazes P, Gottstein B, et al. Challenges for diagnosis and control of cystic hydatid disease[J]. Acta Trop, 2012, 123(1): 1-7. DOI: 10.1016/j.actatropica.2012.02.066

[9] Otero-Abad B, Torgerson PR. Asystematic review of the epide-miology of Echinococcosis in domestic and wild animals[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 7(6): 2249. DOI: 10.1371/journal.pntd.0002249

[10] Zeng XM, Guan YY, Wu WP. Epidemiological distribution characteristics of Echinococcosis[J]. Chin J Zoonoses, 2014, 30(4): 413-417. DOI: 10.3969/j.issn.1002-22694.204.04.014. (in Chinese)

曾祥嫚, 官亞宜, 伍衛(wèi)平. 棘球蚴病的流行病學分布特征[J]. 中國人獸共患病學報, 2014,30(4): 412-417.

[11] Li J, Li J, Peng XY, et al. Cost effectiveness evaluation of four kinds of surgical methods for hepatic echinococcosis [J]. Chin J Zoonoses, 2017, 33(6): 559-563. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.017 (in Chinese)

李婧, 李江, 彭心宇, 等. 肝細粒棘球蚴病4種手術(shù)方式的成本—效果評價[J]. 中國人獸共患病學報, 2017, 33(6): 559-563.