血清硫酸吲哚酚水平與冠心病嚴重程度的關系研究

潘海林　李鋒進　郭凱

1惠州市中心人民醫(yī)院心血管內(nèi)科（廣東惠州 516000）；2龍巖市第一醫(yī)院全科醫(yī)學科（福建龍巖364000）；3南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院心血管病內(nèi)科（廣州 510280）

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）患者的心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）的發(fā)病率和病死率較高。越來越多的研究［1］表明，CKD與冠心病（coronary artery disease，CAD）有部分共同的病理過程并且相互影響。冠狀動脈損傷是由于某些介質對于血管產(chǎn)生的直接毒副作用，如隨著腎功能的惡化產(chǎn)生的尿毒癥毒素［2-3］。蛋白質結合的尿毒癥保留溶質是一系列的難以被透析清除的尿毒癥毒素，他們中的大多數(shù)在CKD患者體內(nèi)聚集，干擾體內(nèi)的代謝系統(tǒng)，并且在炎癥中發(fā)揮著作用，導致心血管的損傷，加速動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）過程［4-6］。硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate，IS）是一種蛋白結合的尿毒癥保留溶質，是吲哚在肝臟中代謝而成的一種有機陰離子［7］。研究［8-16］表明，IS對 AS的多項病理過程有作用，如抑制傷口的愈合和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（ECs）的增殖，增強活性氧（ROS）的產(chǎn)生，增加NAD（P）H的氧活性，通過激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）導致血管平滑肌（VSMCs）增殖，誘導纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI?1）和激活人腎小管上皮細胞的核因子（NF?κB）。另外，研究［12］表明，2型糖尿病和CAD患者的血清IS明顯升高，這種升高與腎功能的退化，炎癥和冠狀動脈粥樣硬化有關。以上IS的毒副作用研究支持IS是心血管風險因素之一，并且與CAD的發(fā)生發(fā)展有關。但目前，血清IS水平與CAD患者的病情嚴重程度的研究相對較少。本研究目的旨在研究這個假說，即血清IS水平和穩(wěn)定型冠心?。–AD）患者的病變血管數(shù)，鈣化分數(shù)，Gensini積分等有關，并且血清IS水平可能也與其他心血管風險因素有關。

1　對象與方法

1.1研究對象連續(xù)收集2016年1月1日至2017年7月1日期間在惠州市中心人民醫(yī)院、龍巖市人民醫(yī)院以及南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院的患者共503例，所有患者均為首次接受冠狀動脈造影檢查，根據(jù)冠脈造影檢查將患者分為穩(wěn)定型心絞痛組（CAD組）和冠脈正常組（非CAD組）。穩(wěn)定型心絞痛的診斷標準為：根據(jù)2007年《慢性穩(wěn)定型心絞痛診斷和治療標準》，穩(wěn)定型心絞痛患者為在冠狀動脈主要分支狹窄≥50%的基礎上，伴有勞力性胸痛，且6個月內(nèi)無胸痛性質惡化以及靜息性胸痛。排除標準：伴有炎癥疾?。ɡ缪装Y、膿毒血癥、惡性腫瘤、肝臟疾病和膠原疾病等）、應用固醇類激素、近期需要進行外科手術、既往有冠脈介入或者冠脈搭橋史、嚴重瓣膜病、嚴重肝腎功能損害、甲狀腺功能異常、血液系統(tǒng)性疾病患者。本研究收集所有入選患者的詳細人口統(tǒng)計學資料，臨床資料，血液學資料以及冠狀動脈造影資料。2型糖尿病的診斷根據(jù)中國2型糖尿病防治指南（2013年版）［17］，即：空腹血糖 ≥ 7.0 mmol/L或葡萄糖負荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L或糖尿病癥狀情況下，隨機血糖≥11.1 mmol/L。原發(fā)性高血壓的診斷根據(jù)中國高血壓防治指南（2010年版）［18］，即在安靜情況下至少2次重復測量血壓≥140/90 mmHg。吸煙定義為平均每天至少1支煙規(guī)律吸煙至少1年。

1.2實驗室檢查所有受試者的血液在測量IS前，均離心并且取上清后分裝凍存。血肌酐、尿酸和血脂檢測均采取標準方法，且均在冠狀動脈造影前。腎功能指標為腎小球濾過率（eGFR），其計算根據(jù)腎臟飲食公式（MDRD）［19］。在測量血清IS前，將甲醇和血清按3∶1的比例混合，使用Waters Acquity超高效液相色譜法系統(tǒng)（UPLC）對其進行檢測。其余實驗室生化指標均參照常規(guī)標準。

1.3冠狀動脈評估冠脈造影檢測根據(jù)常規(guī)標準和方法，斑塊的嚴重程度使用定量冠脈造影系統(tǒng)進行評估。冠狀動脈造影檢查所有入選者均采用Judkins法多體位造影，左冠狀動脈常規(guī)采用6個體位（足位，頭位，右肩位，左肩位，左足位，右足位），右冠狀動脈常規(guī)采用2個體位（左前斜和頭位，部分患者加做左頭位及右前斜）。并根據(jù)美國心臟病協(xié)會的冠狀動脈分段評價標準，采用Gensini積分系統(tǒng)，由2名有經(jīng)驗的醫(yī)師對其造影結果進行重新評估。以每支冠狀動脈血管最嚴重狹窄程度進行定量評定，直徑狹窄＜25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計4分，76%～90%計8分，91%～99%計16分，完全閉塞計32分。根據(jù)不同冠狀動脈乘以相應系數(shù)，左主干病變×5；左前降支病變：近端× 2.5，中端× 1.5，遠端× 1；對角支病變：D1×1，D2×0.5，左旋回支病變：近端 ×2.5，遠端×1；后降支 ×1，后側支 ×0.5；右冠狀動脈病變：近、中、遠和后降支均×1，各狹窄冠脈積分之和即為Gensini積分。使用CAC評分軟件計算Ag?atston評分。每個斑塊的Agatston鈣化評分是通過將冠狀動脈鈣化面積乘以斑塊的峰值信號的加權因子所得。每個斑塊的相加得出總的Agatston鈣化評分。通過將鈣化的病變（以平方毫米測量）的面積乘以截面厚度來計算總鈣化體積。

1.4統(tǒng)計學方法使用Kolmogorov?Smirnov檢測方法對數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布進行檢測。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差的形式進行描述，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用中位數(shù)（四分位數(shù)）進行描述。對于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，兩組間比較統(tǒng)計學差異檢測使用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗。使用多因素的Logistic回歸分析對變量是否獨立與CAD的發(fā)生相關進行分析。使用非CAD組作為對照，IS與CAD的嚴重程度關系的分析使用Logistic回歸分析。計算與冠狀動脈疾病嚴重程度相關的多變量調(diào)整優(yōu)勢比（OR）。多變量調(diào)整的ORs使用95%可信區(qū)間（CI）的方式表示。IS與其他心血管風險因素的關系使用Spearman相關分析進行檢測。應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有P值均為雙側檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1水清IS水平與冠狀動脈狹窄程度有關患者的基線臨床資料、生化和冠脈造影指標等均見表1。CAD患者組的男性較多，平均年齡較大，有更多的吸煙者、高血壓患者、高脂血癥患者以及糖尿病患者。并且CAD組較非CAD組血糖、三酰甘油、尿酸、血肌酐以及Gensini積分均較高，而TC、HDL?C、白蛋白水平以及eGFR均較低。而兩組BMI、收縮壓、舒張壓、LDL?C和總的白細胞水平差異無統(tǒng)計學意義。研究顯示：血清IS水平與性別無關（P＞0.05）。心血管疾病的傳統(tǒng)風險因素除了糖尿病外均與血清IS水平無關（數(shù)據(jù)未列出）。而年齡與血清IS水平明顯相關（β=0、327，P＜0.000 1，n=303）。267例CAD患者根據(jù)病變累及血管支數(shù)，進一步分為1支病變組、2支病變組和3支病變組。CAD組患者的血清IS水平明顯高于非CAD組患者［0.55 mg/L（0.23～ 1.53）vs.0.50 mg/L（0.23～0.83），P=0.026］。并且隨著病變支數(shù)的增多，血清IS水平亦升高（P＜0.05）。

表1　受試者的臨床基線資料和生化學指標Tab.1　Baseline clinical and biochemical characteristics of the study population　±s，例（%），M（P25～ P75）

表1　受試者的臨床基線資料和生化學指標Tab.1　Baseline clinical and biochemical characteristics of the study population　±s，例（%），M（P25～ P75）

注：數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差或中位數(shù)進行描述

變量性別（男/女）年齡（歲）BMI（kg/m2）高血壓高脂血癥糖尿病吸煙收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）血糖（mg/dL）TC（mg/dL）TG（mg/dL）HDL?C（mg/dL）LDL?C（mg/dL）尿酸（mg/dL）血肌酐（mg/dL）白蛋白（g/dL）eGFR［mL/（min·1.73m2）］白細胞總數(shù)（×109/L）IS（mg/L）病變血管支數(shù)（例）總數(shù)（n=503）292/213 62.6±10.2 25.4±4.0 355（70.6）315（62.6）158（31.4）177（35.2）134±22 76±11 123.0±54.0 181.2±47.7 107.0（75.0 ～ 155.3）42.0±13.2 110.3±39.2 6.3±1.8 1.20±0.49 4.0±0.4 65.9±20.3 6.657±2.017 0.49（0.23 ～ 1.25）CAD組（n=267）196/71 64.8±10.2 25.8±4.0 230（86.1）196（73.4）121（45.3）125（46.8）135±22 75±10 138.4±62.7 171.5±42.2 116.5（85.3 ～ 172.8）38.5±11.6 106.2±37.5 6.8±1.9 1.37±0.53 4.0±0.4 57.6±16.9 6.849±2.135 0.55（0.23 ～ 1.53）非CAD組（n=246）124/142 59.2±9.4 24.8±3.9 113（45.9）114（46.3）23（9.3）40（16.3）132±22 77±12 100.1±23.5 196.3±51.9 94.5（64.3 ～ 136.3）48.0±13.8 117.3±41.4 5.7±1.4 0.93±0.25 4.1±0.3 79.1±18.2 6.361±1.794 0.50（0.23 ～ 0.83）P值＜0.000 1 0.000 2 0.099＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.457 0.157＜0.000 1 0.000 4 0.014＜0.000 1 0.065＜0.000 1＜0.000 1 0.040＜0.000 1 0.108 0.026 0123 91 84 92 246斑塊位置左前降支左回旋支右冠狀動脈GS＜0.0001 15.5（0.0 ～ 56.0）137 112 109 36.0（17.0 ～ 83.0）0.0（0.0 ～ 0.0）

2.2血清IS水平與CAD的發(fā)生風險相關包括血清IS水平、傳統(tǒng)心血管疾病風險因素以及其他生化指標在內(nèi)的多因素Logistic回歸分析見表2，血清IS水平、BMI、高血壓、糖尿病、HDL?C、尿酸、eGFR分別與CAD獨立相關。這說明血清IS水平是CAD發(fā)生的風險因素之一。同時，簡單和多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，血清IS水平與病變血管支數(shù)相關。完全調(diào)整比值比（OR）的多重Logistic回歸分析顯示，與一支、兩支、三支血管的OR值分別為0.351（95%CI：0.059 ～ 2.093），3.011（95%CI：1.004 ～ 9.751）和3.076（95%CI：1.138 ～ 8.310）。見表3。

表2　CAD風險和血清IS水平以及其他心血管風險因素的相關性Tab.2　Association of risk of coronary artery disease with indoxyl sulfate and other cardiovascular risk factors

表3　血清IS水平對于CAD嚴重程度的影響Tab.3　Te impact of serum indoxyl sulfate levels on the severity of coronary artery disease

2.3血清IS水平與心血管其他風險因素有關使用Spearman相關分析對血清IS水平心血管風險因素、鈣化積分、Gensini積分以及Framingham 10年風險積分的相關性。結果顯示：血清IS水平與年齡、冠狀動脈鈣化積分、體積鈣化積分、Gensini積分以及Framingham 10年風險積分正相關。另外，血清IS水平與eGFR負相關（表4）。

3　討論

本研究首次證實了與非CAD患者相比，CAD患者的血清IS水平較高，并且血清IS水平與CAD的嚴重程度（Gensini積分、鈣化積分、冠脈斑塊以及Framingham 10年風險積分）明顯正相關，與eG?FR明顯負相關。

IS最初被認為是由于腎功能不全產(chǎn)生的尿毒癥保留溶質。在CKD大鼠模型中，IS可以通過促進TGF?1β、TIMP?1和 Pro?α1 膠原的表達，以及復雜的氧化還原反應，導致腎小球硬化以及腎間質的纖維化［21-23］。IS也可以增加血管平滑肌細胞增生［15］，激活血小板源生長因子受體以及MAPK通路［10］，導致內(nèi)皮和血管功能紊亂。臨床方面，血清IS水平與增加的動脈鈣化和血管增厚有關［2］。有研究［2］表明，血清IS水平的增加與CKD患者的心血管死亡風險有關。泡沫細胞的形成是AS發(fā)生發(fā)展的關鍵。本研究團隊的前期研究也說明了，IS可以通過下調(diào)THP?1源性泡沫細胞的ABCA1、ABCG1和SR?B1蛋白表達，從而減少膽固醇流出率，抑制泡沫細胞的形成。該研究結果證實了，與非CAD患者相比，CAD患者的血清IS水平較高，平且隨著病變程度的加重［20-21］，如Gensini積分、鈣化積分、冠脈斑塊以及Framingham 10年風險積分，其血清IS水平也會隨之上升。這與之前關于IS與內(nèi)皮損傷和心血管風險相關的報道一致［2，9］。眾所周知，輕中度的腎功能減退是冠心病的獨立風險因素，并且與患者心血管事件發(fā)生風險呈負相關［22］，這與筆者的研究結果一致。筆者的研究亦發(fā)現(xiàn)，與非CAD組患者相比，CAD患者的腎功能相對減退，如血肌酐水平升高，eGFR降低。IS作為一種蛋白結合的尿毒癥保留溶質，在CKD患者的血液和組織中大量聚集，其濃度常超過500 μm，而腎功能正常的患者中，其濃度為0.1 ～ 2.39 μm［23］。IS對于AS進展的促進作用，既解釋了IS濃度與患者冠脈狹窄程度有關，也從一定程度上解釋了，CKD患者的CAD以及心血管事件的發(fā)生風險更高。

表4　血清IS水平與心血管風險因素、鈣化積分、Gensini積分以及Framingham 10年風險積分的相關性Tab.4　Spearman rank correlation coefficients between indoxyl sulfate and cardiovascular risk factors，calcium score，Gensini score and Framingham risk score

盡管該研究證實了，高血清IS水平與冠脈動脈粥樣硬化進展有關，但是具體機制仍然不清。除了巨噬細胞，血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞也在AS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。首先，IS作為一種促炎因子可以誘導內(nèi)皮細胞損傷［8-9，24］。其次，IS可以通過增加人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）微分子，從而損傷內(nèi)皮，并且抑制HUVEC的增殖和遷移［22］。IS還可以誘導ROS的產(chǎn)生，增強PDGF誘導的VSMCs的增值和遷移?？傊芯勘砻?，IS可以誘導自由基或微分子的產(chǎn)生，損傷內(nèi)皮，激活NADPH氧化等減少內(nèi)皮抗氧化能力以及增強平滑肌細胞增殖的能力，這些都是冠狀動脈粥樣硬化的始動過程。這有可能是IS與CAD嚴重程度相關的機制之一。

本研究也有一定的局限性。首先對于IS和CAD的關系，本研究屬于橫斷面研究，而非多中心前瞻性的隨機對照研究，其說服力欠佳。另外，對于血清IS的檢測，本研究采用了單一的HPLC的方法，沒有采用多種其他方法進行驗證。因此，為了增強說服力，需要進一步的采用多中心前瞻性的隨機對照研究，并增加隨訪。

總之，穩(wěn)定型CAD患者升高的IS水平與病變血管支數(shù)以及斑塊符合指標有關。因此，IS不僅在CAD的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，而且對于預測CAD的發(fā)生以及嚴重性的評估也有一定的參考價值。

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