直腸癌患者KRAS基因突變和臨床因素對術(shù)后預(yù)后的影響

楊冬陽　馬冬　劉婉薇　賴曉嶸　黎瑩　孟凡　李子俊　徐飛

廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤中心1胃腸腫瘤內(nèi)科，2消化內(nèi)科（廣州510080）

近年來大腸癌在我國的發(fā)病率與病死率呈快速上升趨勢，其中直腸癌發(fā)病年齡中位數(shù)在45歲左右。青年人發(fā)病率有升高的趨勢，需引起足夠的重視［1］，手術(shù)是主要的治療手段，但多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已為中晚期，且晚期患者預(yù)后不佳，需探尋術(shù)后預(yù)后的影響因素，進(jìn)一步指導(dǎo)治療、改善預(yù)后。

目前對直腸癌術(shù)后預(yù)后的影響因素仍在探索中。有研究報道，大腸癌的發(fā)病可能與表皮生長因子受體（EGFR）信號的激活有關(guān)。原癌基因KRAS作為EGFR下游信號通路中重要的分子［2］，已有臨床研究證實KRAS突變可以持續(xù)激活下游Raf/Erk/Map激酶和其他信號通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。但KRAS突變的方式對直腸癌患者預(yù)后進(jìn)程的影響目前僅有有限的資料和數(shù)據(jù)［3-5］。故我院對130例行直腸腫瘤切除術(shù)后的直腸癌患者的KRAS基因突變與手術(shù)預(yù)后及其他病理學(xué)因素之間的關(guān)系進(jìn)行5年隨訪的分析，為術(shù)后直腸癌患者的預(yù)后影響因素尋找依據(jù)。

1　對象與方法

1.1研究對象收集我院2010年1-12月確診直腸腺癌進(jìn)行開腹或腹腔鏡下直腸腫瘤手術(shù)切除的直腸癌患者130例，患者需符合根據(jù)結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010年版）確診為直腸癌的患者；腫瘤病灶可行KRAS檢測；PS評分＜2；年齡≥18歲；性別不限。除外合并其他系統(tǒng)腫瘤；惡液質(zhì)；妊娠或哺乳期婦女、育齡婦女拒絕接受避孕措施者；患者依從性差；預(yù)計生存期＜3個月。納入的130例患者中位年齡63歲，男92例，女38例。KRAS基因型：野生型85例，突變型45例；EGFR表達(dá)級別：EGFR?&+104例，EGFR++&+++26例；P53表達(dá)級別：P53?&+66例，P53++&+++64例；分化程度：低分化21例，中-高分化109例；TNM分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期34例，Ⅲ期52例，Ⅳ期21例；發(fā)生多發(fā)轉(zhuǎn)移：多發(fā)轉(zhuǎn)移8例，其他轉(zhuǎn)移13例和未轉(zhuǎn)移109例；發(fā)生肝轉(zhuǎn)移：肝轉(zhuǎn)移5例，其他轉(zhuǎn)移16例和未轉(zhuǎn)移109例；發(fā)生肺轉(zhuǎn)移：肺轉(zhuǎn)移4例，其他轉(zhuǎn)移17例和未轉(zhuǎn)移109例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)≤3的104例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)＞3的26例；詳細(xì)情況見表1。直腸癌分期標(biāo)準(zhǔn)采用2009年修改的國際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國腫瘤聯(lián)合會（AJCC）聯(lián)合制定的TNM分期法。

1.2實驗方法

1.2.1實驗試劑與儀器DNA提取試劑；TE緩沖液；檢測基因型試劑盒：包含PCR反應(yīng)、SAP反應(yīng)、延伸反應(yīng)等試劑；光學(xué)顯微照相系統(tǒng)；ABI Veriti梯度PCR儀；凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.2.2標(biāo)本采集及處理于腫瘤病灶上提取癌組織，癌組織在固定標(biāo)本并脫水透明后，進(jìn)一步浸蠟包埋及切片，制成組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（HE染色），組織學(xué)診斷由本院2位病理學(xué)專家完成。EGFR、P53免疫組化結(jié)果無陽性染色為陰性（-）；陽性細(xì)胞數(shù)少于10%為弱陽性（+）；10% ～50%為陽性（++）；＞50%為強(qiáng)陽性（+++）。

1.2.3DNA提取和擴(kuò)增本研究采用Goelz氏DNA提取方法對石蠟包埋組織進(jìn)行DNA提取模板DNA。KRAS基因突變的檢測方法采用目前公認(rèn)的直接測序法［6］進(jìn)行。NCBI基因數(shù)據(jù)庫作為引物的參照方，在設(shè)定好的PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，在凝膠成像儀下觀察記錄結(jié)果。

1.2.4基因測序?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物通過純化后，使用焦磷酸測序技術(shù)進(jìn)行測序。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析。Kaplan?Meier法對比直腸癌手術(shù)患者生存與臨床病理學(xué)因素關(guān)系。Log?rank檢驗分析作為顯著性檢驗，對影響直腸癌生存的各種要因進(jìn)行探討?？ǚ綑z驗法評價突變的KRAS基因與手術(shù)后患者臨床病理學(xué)因素之間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1基因分型KRAS為點突變，90%的KRAS基因突變位于2號外顯子的第12和13密碼子位點。入選的130例直腸癌患者中，共45例發(fā)生KRAS基因突變，突變率為34.6%，12密碼子和13密碼子有共同突變的頻率為0%。其中12密碼子突變和13密碼子突變的頻率分別為93.4%和6.6%。

2.2KRAS基因突變和直腸癌手術(shù)患者臨床病理學(xué)因素的關(guān)系KRAS基因突變與EGFR更強(qiáng)的陽性表達(dá)、腫瘤的多發(fā)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.05）；與手術(shù)患者的其他病理學(xué)因素如P53、TNM分期、腫瘤分化程度、性別、年齡、肝臟轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移和其他淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)因素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.3直腸癌患者預(yù)后相關(guān)因素分析130例患者追蹤隨訪發(fā)現(xiàn)，至2016年1月，共71例患者生存，總的平均生存期為56.2個月，5年生存率為54.8%（圖1）。Kaplan?Meier法單因素分析結(jié)果（表2）顯示，野生型的KRAS基因患者手術(shù)后平均生存時間為57.5個月，突變型的KRAS基因患者手術(shù)后平均生存時間為58.9個月，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。

其他臨床病理學(xué)因素與手術(shù)預(yù)后生存期關(guān)系如下：TNM分期與患者預(yù)后相關(guān)，Ⅰ期患者平均生存時間為65.0個月，Ⅱ期患者平均生存時間為59.7個月，Ⅲ期患者平均生存時間為56.4個月，Ⅳ期患者平均生存時間為49.0個月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。同時我們發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移對直腸癌患者的手術(shù)預(yù)后具有顯著影響，Kaplan?Meier法單因素分析顯示多發(fā)轉(zhuǎn)移（P＜0.05，圖4）、肝轉(zhuǎn)移（P＜ 0.05，圖5）、肺轉(zhuǎn)移（P＜0.05，圖6）與直腸癌患者預(yù)后不良關(guān)系密切。

3　討論

KRAS基因不僅是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的因素，也在EGFR信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。KRAS基因的突變可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、血管形成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞局部侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使正常EGFR信號通路的調(diào)控?zé)o法進(jìn)行，KRAS基因突變在腸癌突變率為20%～60%［6］。有研究者認(rèn)為，腸癌惡性腫瘤的KRAS基因突變具有預(yù)測預(yù)后的價值［7-12］，也有學(xué)者認(rèn)為KRAS基因突變對腸癌預(yù)后并無影響［13-17］。

表2　直腸癌患者預(yù)后影響因素的Kaplan?Meier法單因素分析Tab.2　Kaplan?Meier analysis method of the single factor effect of patients with rectal cancer prognostic factors

本研究提示130例直腸癌術(shù)后患者KRAS突變率為34.6%，現(xiàn)階段國際報道KRSA突變率為30% ～ 35%［8］，較常見第12位密碼子突變［18］，提示中國直腸癌患者KRAS基因突變率和國際的類似。χ2檢驗提示KRAS基因突變與EGFR更強(qiáng)的陽性表達(dá)及直腸癌多發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，發(fā)現(xiàn)直腸癌的多發(fā)轉(zhuǎn)移和KRAS突變有關(guān)系，提示患者EGFR高表達(dá)和患者多發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生KRAS突變的幾率更高。KRAS基因突變與其他病理學(xué)因素如P53表達(dá)、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、性別、年齡等無相關(guān)。

圖1　130例直腸癌患者的總體生存曲線　圖2　KRAS不同基因型患者的總體生存曲線　圖3　不同分期直腸癌患者總體生存曲線Fig.1　130 overall survival curves of with different genotypes　Fig.2　The overall survival curves of KRAS patients patients with rectal cancer　Fig.3　The overall survival curves of different Stages of colorectal cancer patients

圖4　是否有多發(fā)轉(zhuǎn)移直腸癌患者的總體生存曲線　圖5　是否有肝轉(zhuǎn)移的直腸癌患者總體生存曲線　圖6　是否有肺轉(zhuǎn)移的直腸癌患者總體生存曲線Fig.4　The overall survival curve of patients with multiple metastatic colorectal cancer　Fig.5　Whether patients with rectal cancer survival curve of liver metastasis　Fig.6　Whether patients with rectal cancer survival curve of lung metastasis

進(jìn)一步單變量統(tǒng)計分析提示野生型KRAS基因患者的預(yù)后對比突變型KRAS基因患者的預(yù)后，兩者的總體生存無明顯差異。一個腸癌的研究［13］中認(rèn)為KRAS基因突變并不對腸癌患者預(yù)后有預(yù)測價值，其他KRAS基因突變的回顧性臨床研究［14-17］也得出了相似的結(jié)論。但是目前的主流觀點［7-12］仍然是KRAS基因突變對腸癌患者的預(yù)后存在一定的影響。

然而，目前學(xué)術(shù)界對上述兩種不同的觀點的爭論存在另外一種看法，有學(xué)者認(rèn)為，KRAS基因突變率的檢測率易受到環(huán)境因素、檢測方法的特異性和敏感性、樣本量的多少等的影響［19］，這些因素都會影響KRAS基因突變率的最終結(jié)果。本研究認(rèn)為可能與以下原因有關(guān)：研究群體的異質(zhì)性，如早期病例的研究人群較少；KRAS基因突變的檢測方法的局限性，KRAS野生型患者用直接測序法進(jìn)行檢測易獲得假陰性結(jié)果；KRAS突變的量（突變豐度）的不同對患者的預(yù)后產(chǎn)生影響［20］，在低靈敏度的方法檢測下，突變豐度低的患者被檢測為野生型，導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確。

另外，2013年的歐洲癌癥大會上德國腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)會合作調(diào)查小組認(rèn)為，僅僅檢測KRAS基因的突變是不足以用于進(jìn)行腸癌患者的關(guān)鍵治療策略的抉擇的。目前，最新的進(jìn)展認(rèn)為，進(jìn)行KRAS、BRAF、NRAS的全面檢測，對判斷治療及對預(yù)后的影響分析是更有益的［21］，受限于2010年的檢測手段，當(dāng)時檢測選擇僅限KRAS。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)我們的研究群體主要是行腫瘤切除手術(shù)后的患者，與既往大部分的研究有比較大的區(qū)別，該群體的身體狀況、耐受性、可預(yù)期壽命可能更長，故患者的存活時間均比較長。尤其對于晚期患者，我們發(fā)現(xiàn)這類患者在進(jìn)行直腸癌手術(shù)治療后，總體的生存期得到較好的體現(xiàn)，提示晚期患者能進(jìn)行直腸癌的手術(shù)治療可能的獲益及預(yù)后的判斷，也有研究認(rèn)為，在提高患者生存率及生存時間上，行腫瘤切除手術(shù)往往比單純化療更有效［9］。進(jìn)一步分析患者的其他病理學(xué)因素與手術(shù)預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，腫瘤TNM分期和腫瘤的轉(zhuǎn)移部位多發(fā)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移與直腸癌患者預(yù)后不良關(guān)系密切。

綜上所述，KRAS基因突變與EGFR更強(qiáng)的陽性表達(dá)和腫瘤的多發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，TNM高分期，轉(zhuǎn)移部位影響手術(shù)預(yù)后，Ⅳ期患者直腸癌手術(shù)切除后有提高生存趨勢，KRAS基因突變對于直腸癌患者手術(shù)預(yù)后的關(guān)系尚不明確，我們須進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，改進(jìn)KRAS基因突變的檢測方法，使用合適的方法進(jìn)行全RAS的檢測，進(jìn)一步進(jìn)行研究。

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