cntf基因A/G多態(tài)性作為東北地區(qū)雪上技能主導(dǎo)類運(yùn)動(dòng)員早期選材的相關(guān)性研究

李　麗，周桐希

多年研究實(shí)踐表明：運(yùn)動(dòng)成績(jī)的取得與運(yùn)動(dòng)天賦和刻苦的訓(xùn)練密不可分，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格和刻苦的訓(xùn)練并不一定能取得優(yōu)秀的運(yùn)動(dòng)成績(jī)，其原因在于不同人帶有不同遺傳素質(zhì)基因，也就是運(yùn)動(dòng)天賦不同.只有具有優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)基因的人經(jīng)過(guò)科學(xué)訓(xùn)練才能獲得優(yōu)異成績(jī).縱觀我國(guó)運(yùn)動(dòng)員選材的發(fā)展，主要為經(jīng)驗(yàn)選材法［1］、形態(tài)學(xué)選材法、家族選材法、PTC嘗味能力選材法、皮紋選材法、血型選材法及生理生化指標(biāo)選材法.以上選材方法不能得出客觀、準(zhǔn)確的結(jié)論.

目前，分子生物學(xué)技術(shù)已得到廣泛的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因研究領(lǐng)域進(jìn)行大量研究，已取得了有意義的成果.cntf（ciliary neuro?trophic factor）基因全稱為睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子.cntf能夠促進(jìn)突觸處神經(jīng)分化，故神經(jīng)發(fā)生損傷時(shí)能起到修復(fù)作用，即使神經(jīng)元沒(méi)發(fā)生損傷也能延緩其衰退［2］.Oppenheim RW［3］證實(shí) cntf可維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元正?；顒?dòng)從而延緩其衰退；Anderson KD、Emerich DF和Emerich DF［4-6］實(shí)驗(yàn)證實(shí)外源性的cntf對(duì)被損傷的神經(jīng)有修復(fù)作用.相關(guān)研究表明cntf基因多態(tài)性與力量素質(zhì)相關(guān).近年來(lái)對(duì)于cntf基因與運(yùn)動(dòng)能力的相關(guān)性研究較少，黃昌林等［7］通過(guò)對(duì)攜帶AG基因型和GG基因型的我國(guó)軍人（男性、漢族）的握力測(cè)試，實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果顯示此兩種基因型的力量與體指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.韓偉等［8］對(duì)我國(guó)越野滑雪運(yùn)動(dòng)員cntf基因三種基因型與普通人進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究得出的結(jié)論是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

基因選材是一種準(zhǔn)確、客觀、科學(xué)的選材依據(jù)，需要大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持.冰雪項(xiàng)目基因選材方面的工作現(xiàn)在還沒(méi)有得到全面的開(kāi)展，缺少運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目、實(shí)驗(yàn)方面的數(shù)據(jù)支持.2022年冬奧會(huì)在我國(guó)舉行，冬季項(xiàng)目選材和訓(xùn)練工作得到重視.此項(xiàng)目現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了一批具有世界水平的運(yùn)動(dòng)員，但后備人材的短缺制約著項(xiàng)目長(zhǎng)期發(fā)展.利用當(dāng)前優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員的寶貴資源，對(duì)他們進(jìn)行相關(guān)選材指標(biāo)尤其是基因指標(biāo)的測(cè)定，對(duì)于我國(guó)建立優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員選材模型具有重要意義.本課題研究旨在對(duì)cntf基因能否作為雪上技能主導(dǎo)類運(yùn)動(dòng)員基因選材指標(biāo)進(jìn)行篩選，可為冰雪運(yùn)動(dòng)員的基因選材做前期積累工作.

1　研究對(duì)象與方法

1.1　研究對(duì)象

東北地區(qū)單板大跳臺(tái)和坡式障礙優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員為實(shí)驗(yàn)組，普通高校大學(xué)生為對(duì)照組.

實(shí)驗(yàn)組：東北地區(qū)單板大跳臺(tái)和坡式障礙優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員為實(shí)驗(yàn)組.測(cè)試對(duì)象：東北地區(qū)單板大跳臺(tái)和坡式障礙優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員21名（女11名、男子10名）.國(guó)際運(yùn)動(dòng)健將級(jí)別運(yùn)動(dòng)員2名，國(guó)家一級(jí)運(yùn)動(dòng)員5名，其余為國(guó)家二級(jí)運(yùn)動(dòng)員.平均運(yùn)動(dòng)年限7年，年齡在10～26歲.

對(duì)照組：選取參加全國(guó)高考的非體育專業(yè)考生，在高中階段未參加過(guò)系統(tǒng)的體育訓(xùn)練，未曾經(jīng)過(guò)體育術(shù)科考試，進(jìn)入體院后沒(méi)有進(jìn)行專項(xiàng)訓(xùn)練.運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)專業(yè)、體育人文專業(yè)本科生共115名.所有測(cè)試人員種族一致，年齡在16～23歲；調(diào)查表明本人無(wú)任何重大疾病，測(cè)試時(shí)保證身體健康.以上參加測(cè)試的人員均來(lái)自于中國(guó)北方漢族.

1.2　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

采用分子生物學(xué)PCR-RFLP的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的cntf基因A/G多態(tài)性進(jìn)行測(cè)定.

1.3　主要實(shí)驗(yàn)儀器

PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)艾本德股份公司GSX1）；電泳儀（北京市六一儀器廠DYY-6D）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple公司Alphaimager Mini）.

1.4　實(shí)驗(yàn)操作主要過(guò)程

（1）全血DNA提取.靜脈取新鮮全血5ml放入到帶抗凝劑的試管中，按照普瑞麥格全血DNA攝取試劑盒操作.

（2）設(shè)計(jì)cntf基因的引物.查找Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)嚴(yán)格按照引物設(shè)計(jì)原則.依據(jù)Thome［9］等報(bào)道的cntf的引物序列和cntf基因多態(tài)位點(diǎn)的特點(diǎn)，利用Primer select 5.0軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物，提供給生物科技公司，由上海捷瑞公司合成，放在冰箱中保存.

（3）擴(kuò)增cntf基因.擴(kuò)增cntf基因的反應(yīng)體系包括：Taq 酶 0.25μl、5×Taq Buffer 5μl、dNTP 0.5μl、滅菌雙蒸水15.25μl、上下游引物各1μl、以及DNA模板2μl，共25μl.

（4）cntf基因 PCR擴(kuò)增參數(shù).95℃預(yù)變性5min；94℃變性5min35s、58℃退火30s、72℃延伸15s，共循環(huán)36次；72℃終末延伸8min；4℃保存.

（5）cntf基因A/G多態(tài)位點(diǎn)的酶切反應(yīng)體系.cntf基因A/G多態(tài)位點(diǎn)的酶切反應(yīng)體系包括：HaeⅢ限制性內(nèi)切酶0.4μl、Buffer 0.2μl、BSA 0.1μl，以及擴(kuò)增產(chǎn)物17.3μl，共18μl.

（6）電泳.依據(jù)所測(cè)得物質(zhì)的分子量來(lái)確定濃度為：DNA由于分子量大確定濃度為0.8%；cntf基因經(jīng)過(guò)酶切分子量濃度為3%.設(shè)置電泳儀器U=100V、P=50W、I=50mA，時(shí)間50min.電泳完畢后，觀察凝膠采用紫外可見(jiàn)光分析裝置，利用軟件分析結(jié)果.

1.5　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

（1）對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的基因型頻率分布運(yùn)用基因平衡定律（Hardy-Weinberg，H-W）對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，確定所測(cè)人群的群體代表性，利用遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)三種基因不同多態(tài)性的頻率和等位基因進(jìn)行整理.

（2）用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用卡方對(duì)基因型和等位基因頻率進(jìn)行檢驗(yàn)，（P＜0.05）為顯著差異，（P＜0.01）極其顯著差異.

2　cntf基因A/G多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）cntf基因A/G多態(tài)性的判斷.睫狀神經(jīng)因子cntf基因保證雞胚睫狀神經(jīng)元最初從雞眼睛中提取.它是一個(gè)酸性蛋白質(zhì)，具有200個(gè)殘基的氨基酸，是一種細(xì)胞因子，屬于白介素6家族.人的cntf基因定位第11號(hào)染色體長(zhǎng)臂近端，由兩個(gè)外顯子和一個(gè)1kb左右內(nèi)含子組成，本實(shí)驗(yàn)中HaeⅢ酶切多態(tài)位點(diǎn)位于第二個(gè)外顯子和內(nèi)含子之間，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增后的長(zhǎng)度為134bp，用HaeⅢ酶切后所得到產(chǎn)物G等位基因是40bp和94bp，A等位基因是134bp沒(méi)有酶切位點(diǎn)，出現(xiàn)的三種基因型是AG、AA、GG.cntf基因A/G凝膠電泳圖（見(jiàn)圖1）.

圖1　cntf基因A/G凝膠電泳圖

Marker電泳條帶：Lane 1為 100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp.

純合子AA電泳條帶：Lane 4.

純合子GG電泳條帶：Lane 13、10、9、8、7、6、5、3、2.

雜合子AG電泳條帶：Lane 12、11.

PCR產(chǎn)物電泳條帶：Lane 14.

（2）cntf基因A/G多態(tài)性基因頻率的平衡檢驗(yàn).由表1得出：經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律的檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的HEW值為1.64和1.34.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組基因型頻率因（P＞0.05）符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn).結(jié)果顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組cntf基因A/G多態(tài)性頻率分布符合遺傳定律.

表1　cntf基因A/G多態(tài)性頻率分布的Hardy-Weinberg平衡定律的檢驗(yàn)

（3）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組cntf基因A/G多態(tài)性等位基因頻率的檢驗(yàn).表2表明：無(wú)論實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組的等位基因G頻率都高于A頻率，A等位基因?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組分別為14.3%和18.7%，G等位基因?yàn)?5.7%和81.3%.經(jīng)卡方檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組等位基因頻率χ2=0.468，χ2（0.05）=5.99，χ2＜χ2（0.05）.結(jié)論P(yáng)=0.494（P＞0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

表2　實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組cntf基因A/G多態(tài)性等位基因頻率分布

（4）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組cntf基因A/G多態(tài)性頻率的卡方檢驗(yàn).據(jù)表3表明：實(shí)驗(yàn)組AA基因型頻率為19.0%，AG基因型頻率為4.8%，GG基因型頻率為76.2%；對(duì)照組AA基因型頻率為25.2%，AG基因型頻率為6.1%，GG基因型頻率為68.7%.經(jīng)卡方檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組基因型頻率χ2=0.474，χ2（0.05）=5.99，χ2＜χ2（0.05）.結(jié)論P(yáng)=0.789（P＞0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.cntf基因A/G多態(tài)性分布頻率的順序：①GG型，②AA型，③AG型.

表3　實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組cntf基因A/G多態(tài)性頻率

3　分析與討論

cntf基因能增加體內(nèi)外大部分神經(jīng)元的存活、阻止損傷后神經(jīng)元的衰退、促進(jìn)其恢復(fù)和影響神經(jīng)元分化，增進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活并具有保護(hù)作用［10］.這可能是cntf基因與力量素質(zhì)有關(guān)的原因之一.Roth Stephen M通過(guò)對(duì)cntf多態(tài)性實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，A/G型在進(jìn)行快速運(yùn)動(dòng)時(shí)比G/G型產(chǎn)生的肌肉力量更大［11］.cntf基因能保持骨骼肌的形態(tài)和功能，增加肌纖維數(shù)目、減少由于缺少神經(jīng)支配、衰老等原因而造成的肌萎縮、肌肉力量下降.它有營(yíng)養(yǎng)肌肉的作用，cntf的受體存在于骨骼肌纖維中，兩者的結(jié)合對(duì)骨骼肌纖維的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，在促進(jìn)長(zhǎng)粗的同時(shí)通過(guò)對(duì)肌纖維的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控作用以提高肌肉的功能［12］.由于肌纖維營(yíng)養(yǎng)充足，促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)合成使得肌纖維生理橫斷面積粗大，由于生理橫斷面積變粗、突觸部位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和所支配的肌纖維的數(shù)量增加，從而促進(jìn)肌肉力量的增長(zhǎng).研究顯示：cntf對(duì)神經(jīng)肌肉的病癥可能有治療作用，如早期阿爾茨海默病、帕金森氏綜合癥和重癥肌無(wú)力［13］.實(shí)驗(yàn)表明，24個(gè)月的老年鼠坐骨神經(jīng)cntf的表達(dá)量比6個(gè)月成年鼠低2～4倍，讓其進(jìn)行游泳訓(xùn)練，cntf的含量與游泳速度呈高度相關(guān)（P＜0.0003）.老年鼠比目魚肌肌肉力量經(jīng)過(guò)cntf處理14天后，肌力增加2.5倍（P＜0.001）.此研究證實(shí)：cntf基因與肌肉力量相關(guān).

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，對(duì)照組基因型頻率P=1.34，實(shí)驗(yàn)組基因型頻率P=1.64（P＞0.05）符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性.運(yùn)動(dòng)員組與對(duì)照組cntf基因的多態(tài)性中G等位基因分布頻率普遍偏高，實(shí)驗(yàn)組基因型頻率經(jīng)卡方檢驗(yàn)運(yùn)動(dòng)員基因型頻率與對(duì)照組相比（P＞0.05）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此結(jié)果表明cntf基因A/G多態(tài)性，不可成為早期選材的指標(biāo)，但研究結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)員組G等位基因頻率高.

分析其可能原因：實(shí)驗(yàn)組21個(gè)，全部為東北地區(qū)單板大跳臺(tái)和坡式障礙優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員，此兩類項(xiàng)目屬于技能主導(dǎo)類項(xiàng)群.雖為省級(jí)運(yùn)動(dòng)員，但全國(guó)此類項(xiàng)目?jī)?yōu)秀運(yùn)動(dòng)員全部集中于東北三省，尤其黑龍江省是雪上項(xiàng)目的強(qiáng)省.可以說(shuō)，此21名運(yùn)動(dòng)員代表國(guó)家的水平.人數(shù)少是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要因素.隨著國(guó)家對(duì)冰雪項(xiàng)目越來(lái)越重視，在國(guó)家和地方政府的大力扶持下，運(yùn)動(dòng)員的人數(shù)會(huì)逐漸增多，在今后的研究中增加實(shí)驗(yàn)組的人數(shù)或通過(guò)增加同一項(xiàng)群實(shí)驗(yàn)人員的數(shù)量，再進(jìn)行進(jìn)一步研究以期得到客觀的結(jié)論.

4　結(jié)論

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律的檢驗(yàn)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組cntf基因A/G多態(tài)性頻率分布符合遺傳定律，具有群體代表性.

cntf基因A/G多態(tài)性，不可成為早期選材的指標(biāo)，但研究結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)員組G等位基因頻率高.

通過(guò)研究了解我國(guó)技能主導(dǎo)類滑雪運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因多態(tài)性的分布，以單板大跳臺(tái)和坡式障礙項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員基因選材為突破點(diǎn)，逐步開(kāi)展我國(guó)冰雪運(yùn)動(dòng)員的基因選材工作，并在后備運(yùn)動(dòng)員選材過(guò)程中提供數(shù)據(jù)上的支持和選材標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)此項(xiàng)目的長(zhǎng)期發(fā)展具有參考作用.

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