基于直鏈淀粉衍生物手性固定相的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法拆分4種β-受體阻滯劑對映體及其分離機制的探討

錢哲元,　張明勇,　李升妮,　洪戰(zhàn)英,　柴逸峰(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200433)

β-受體阻滯劑藥物,又名洛爾類藥物,具有降低血壓、減慢心率、改善心肌缺血和心功能的作用,被用于治療高血壓、心絞痛和心律失常等疾病[1]。β-受體阻滯劑根據(jù)其作用特點可分為三類[2-4]:第一類為非選擇性阻斷β1和β2受體,常用藥物為普萘洛爾;第二類為選擇性阻斷β1受體,常用藥物為美托洛爾;第三類為非選擇性阻斷β1和β2受體,同時阻斷α1受體,具有外周擴血管的作用,常用藥物為阿羅洛爾和卡維地洛，以上4種典型代表性藥物的結(jié)構(gòu)式見圖1。這類藥物結(jié)構(gòu)中含有手性中心,臨床上多以消旋體形式給藥,但其對映體的藥理、藥代和毒理作用具有顯著性差異,左旋體的藥理活性明顯高于右旋體[5,6]。普萘洛爾左旋體的β受體阻斷作用比右旋體強約100倍[7];美托洛爾左旋體的β受體阻斷作用是右旋體的33倍[8];S-卡維地洛的β受體阻斷活性大約是R-卡維地洛的200倍[9];S-阿羅洛爾的藥理活性比R-阿羅洛爾強[10]。因此,建立β-受體阻滯劑對映體手性拆分方法,對該類藥物的質(zhì)量控制及其藥理、藥代和毒理作用研究具有重要意義。

圖 1　普萘洛爾、美托洛爾、卡維地洛和阿羅洛爾的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1　Chemical structures of propanolol, metoprolol, carvedilol and arotinolol * Chiral center.

手性藥物拆分常用的方法包括氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳法(CE)、超臨界流體色譜法(SFC)和薄層色譜法(TLC)等[11]。目前主要采用手性固定相法[12-18]、手性流動相添加法[19,20]和手性試劑衍生化法[21]對β-受體阻滯劑對映體進行拆分,尤其以手性固定相法的應(yīng)用居多,測定對象多為普萘洛爾和美托洛爾等,鮮見對阿羅洛爾拆分的研究。近年來,HPLC-MS/MS技術(shù)集合了高效液相色譜的高分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜高選擇性、高靈敏度的特點,成為手性藥物分析研究的有效手段之一。直鏈淀粉-三(3,5-二甲苯氨基甲酸酯)手性固定相(Chiralpak AD-H)具有較高的對映體選擇性,且負載量大,在手性拆分中的應(yīng)用較為廣泛[15,22]。目前尚未見以Chiralpak AD-H為手性柱的HPLC-MS/MS方法同時拆分多種β-受體阻滯劑對映體的文獻報道。

本文應(yīng)用HPLC-MS/MS分析技術(shù),在正相洗脫方式下使用Chiralpak AD-H手性固定相對普萘洛爾、美托洛爾、阿羅洛爾和卡維地洛4種β-受體阻滯劑對映體進行拆分?？疾炝鲃酉嘀懈男詣┖吞砑觿┑捏w積分數(shù)、柱溫和流速等因素對保留時間(t)、選擇因子(α)和分離度(R)的影響,同時優(yōu)化了色譜和質(zhì)譜條件,并對拆分機理進行了初步探討。

1　實驗部分

1.1　儀器和試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(含G1312A二元泵、G1322A脫氣機和G1316A柱溫箱)、 CTC PAL自動進樣器(美國Agilent公司); API 4000質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司); CP225D電子天平(德國Sartorius公司)。

對照品:普萘洛爾(純度99.5%, Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司);鹽酸阿羅洛爾(純度99.5%,日本住友制藥株式會社);美托洛爾(純度98%)、卡維地洛(純度98%)(加拿大Toronto Research Chemicals公司)。正己烷和乙醇為色譜純(Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司);二乙胺為色譜純(上海安譜實驗科技股份有限公司);甲醇為色譜純(德國Merck公司)。

1.2　標準溶液配制

精密稱取普萘洛爾、美托洛爾、阿羅洛爾和卡維地洛對照品適量,分別用甲醇溶解,配制成質(zhì)量濃度為1.00 g/L的標準儲備液,于4 ℃保存;使用時取適量藥物標準儲備液,用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為10 μg/L的單標準溶液;根據(jù)實驗需要用甲醇配制成合適濃度的混合標準溶液。

1.3　液相色譜條件

色譜柱:Chiralpak AD-H柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,大賽璐藥物手性技術(shù)(上海)有限公司);預(yù)柱:Supelco ColumnSaver在線過濾器(0.5 μm, Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司);柱溫:40 ℃;流動相:正己烷-乙醇-二乙胺(20∶80∶0.03, v/v/v);等度洗脫;流速:0.550 mL/min;進樣量:10 μL (10 μg/L)。

1.4　質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子(ESI)源,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)、正離子模式;離子源溫度(TEM)500 ℃;離子源噴霧電壓(IS)4 500 V;離子源氣體1(GS1)壓力310.3 kPa,離子源氣體2(GS2)壓力206.8 kPa;氣簾氣(CUR)壓力137.9 kPa;碰撞氣(CAD)8 unit。普萘洛爾、美托洛爾、阿羅洛爾和卡維地洛的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1　4種β-受體阻滯劑對映體的質(zhì)譜參數(shù)Table 1　MS parameters of the four β-blocker enantiomers

DP: declustering potential; CE: collision energy; EP: entrance potential; CXP: collision cell exit potential.

1.5　對映體拆分的熱力學(xué)過程

液相色譜手性拆分中,對映體在色譜固定相和流動相之間的分離是其自由能之差ΔΔG0(J/mol)所致,對映體之間的α與其關(guān)系如下[23-25]:

lnα=-ΔΔG0/RT=-ΔΔH0/RT+ΔΔS0/R

(1)

其中,T是絕對溫度(K), R為氣體常數(shù)(8.314 J/(mol5K)), ΔΔH0(J/mol)、ΔΔS0(J/(mol5K))分別為被分離組分在固定相和流動相間分配的焓變之差和熵變之差。本研究根據(jù)優(yōu)化的色譜條件,測定各對映體的保留因子(k)和α,根據(jù)公式(1),對lnα～1/T作圖,計算熱力學(xué)參數(shù),初步探討β-受體阻滯劑對映體拆分的原理。

2　結(jié)果與討論

2.1　固定相的選擇

本研究比較了大賽璐藥物手性技術(shù)(上海)有限公司的Chiralpak AD-H色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Chiralcel OD-H色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,固定相為纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))和Sigma Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司的CYCLOBOND I 2000SP手性柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,固定相為S-羥丙基醚衍生化的β-環(huán)糊精)對普萘洛爾、美托洛爾、阿羅洛爾和卡維地洛對映體的拆分效果。結(jié)果表明,Chiralcel OD-H色譜柱不能拆分阿羅洛爾和卡維地洛對映體;CYCLOBOND I 2000SP手性柱無法拆分4種藥物對映體;Chiralpak AD-H色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)能對4種藥物對映體實現(xiàn)拆分。因此選擇Chiralpak AD-H色譜柱進行后續(xù)實驗條件的優(yōu)化。

2.2　流動相中有機相改性劑體積分數(shù)的選擇

醇類作為有機改性劑可使對映體與固定相上的氨基甲酸酯基之間形成氫鍵,不同結(jié)構(gòu)的醇類會使固定相形成不同手性空穴的空間環(huán)境,使對映體分子與固定相中的苯基氨基甲酸酯之間的互相作用發(fā)生變化,從而影響手性藥物的分離[26]。

本研究以正己烷為流動相主體,乙醇為有機改性劑,在柱溫40 ℃、流速0.400 mL/min、流動相中添加0.02%(v/v)二乙胺的色譜條件下,考察在不同體積分數(shù)的乙醇條件下普萘洛爾、美托洛爾、阿羅洛爾和卡維地洛對映體的保留時間、選擇因子和分離度(見表2)。隨著乙醇體積分數(shù)的降低,普萘洛爾、美托洛爾、阿羅洛爾和卡維地洛的保留時間均增加,分離度也增加,但選擇因子變化不大。這可能是因為流動相中極性成分與固定相形成氫鍵,抑制了對映體與固定相之間的氫鍵作用,因此降低乙醇的體積分數(shù)有利于對映體的分離。但當乙醇體積分數(shù)較低時,會大大增加各藥物的保留時間,同時擴散作用也使得峰形變寬。當乙醇的體積分數(shù)為80%時,各化合物保留時間最短,峰形最好,且分離度均良好。

表 2　乙醇體積分數(shù)對4種β-受體阻滯劑對映體分離的影響Table 2　Effect of volume fraction of ethanol on the enantioseparation of the four β-blocker enantiomers

t1,t2: retention times of enantiomers;α: selective factor;R: resolution.

2.3　流動相中二乙胺的體積分數(shù)對拆分的影響

本研究中4種β-受體阻滯劑藥物均為弱堿性藥物,在流動相中添加二乙胺可抑制其離子化;二乙胺還能與手性柱上殘留的硅羥基結(jié)合,增強手性識別能力[27]。當流動相不添加二乙胺時,各藥物對映體的分離度均不佳。在柱溫40 ℃、流速0.550 mL/min、流動相正己烷-乙醇(20∶80, v/v)的色譜條件下,考察流動相中添加不同體積分數(shù)(0.01%～0.05%)的二乙胺對分離的影響(見圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),4種藥物對映體分離度隨二乙胺體積分數(shù)的增大而增加?？紤]到二乙胺的體積分數(shù)對4種藥物對映體保留時間和選擇因子的影響不大，以及二乙胺對質(zhì)譜響應(yīng)的影響,最終選擇正己烷-乙醇-二乙胺(20∶80∶0.03, v/v/v)為流動相。

圖 2　流動相中二乙胺的體積分數(shù)對4種β-受體阻滯劑對映體分離度的影響Fig. 2　Effect of volume fraction of diethylamine in mobile phases on the resolution of the four β-blocker enantiomers

2.4　流速對拆分的影響

本研究在柱溫40 ℃、流動相正己烷-乙醇-二乙胺(20∶80∶0.03, v/v/v)的色譜條件下,考察了流速對4種β-受體阻滯劑對映體分離效果的影響。當流速從0.550 mL/min降至0.300 mL/min時,分離度和保留時間均增加,但低流速會因為分子擴散和傳質(zhì)阻力導(dǎo)致目標物色譜峰展寬。當流速為0.550 mL/min時,各化合物出峰時間短,峰形好,且對映體分離度均良好,故本實驗選擇0.550 mL/min的流速進行分離。

2.5　柱溫對拆分的影響

柱溫是HPLC手性分離的重要影響因素,柱溫的改變會影響對映體的保留時間、選擇因子、分離度和對映體在固定相上吸附、解出的速率,甚至可能導(dǎo)致手性固定相結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,影響溶質(zhì)與固定相間的作用,使對映體洗脫順序反轉(zhuǎn)[28]。

圖 3　柱溫對4種β-受體阻滯劑對映體(a)保留時間和(b)分離度的影響Fig. 3　Effect of column temperature on the (a) retention time and (b) resolution of the four β-blocker enantiomers

本研究在流速為0.550 mL/min、流動相為正己烷-乙醇-二乙胺(20∶80∶0.03, v/v/v)的色譜條件下,考察了柱溫為25、35、40和45 ℃時4種β-受體阻滯劑對映體的t1和R的變化情況(見圖3)。當柱溫從25 ℃升高至40 ℃時,各藥物的t1縮短,R下降。因為柱溫升高使得溶質(zhì)在固定相和流動相中傳質(zhì)速度變快,從而改變了溶質(zhì)與固定相間的手性作用力。當柱溫為45 ℃時,目標物的t1增長,色譜峰形變差,R增加,這可能是由于柱溫升高,手性固定相的構(gòu)型改變,導(dǎo)致保留機制或?qū)τ丑w與固定相之間的手性識別作用發(fā)生了改變。當柱溫為40 ℃時,卡維地洛的t1顯著縮短,其余對映體保留時間無明顯變化,且各對映體能實現(xiàn)基線分離,綜合保留時間和色譜峰形這兩個因素,為了實現(xiàn)快速分離的目的,最終選擇柱溫為40 ℃。

2.6　分離度和重復(fù)性

綜合考慮分析時間和分離效果等因素,確定同時拆分普萘洛爾、美托洛爾、阿羅洛爾和卡維地洛對映體的最佳實驗條件,流動相為正己烷-乙醇-二乙胺(20∶80∶0.03, v/v/v)、流速為0.550 mL/min、柱溫為40 ℃。在此條件下連續(xù)進樣10次,4種對映體出峰時間和峰面積的RSD均小于10%。各化合物的保留時間、選擇因子和分離度見表3,典型色譜圖見圖4。該方法能同時拆分4種洛爾類對映體,簡單、快速,且重復(fù)性好。

表34種β-受體阻滯劑對映體的保留時間、選擇因子和分離度

Table3Retention times, selective factors and resolutions of the fourβ-blocker enantiomers

Compoundt1/mint2/minαRPropanolol6．717．491．121．37Metoprolol7．168．081．141．80Arotinolol7．889．301．192．09Carvedilol17．1123．721．404．70

圖 4　4種β-受體阻滯劑對映體的典型手性拆分色譜圖Fig. 4　Typical enantioseparation chromatograms of the four β-blocker enantiomers

2.7　對映體拆分機理的探討

2.7.1對映體拆分的熱力學(xué)參數(shù)

本實驗以正己烷-乙醇-二乙胺(20∶80∶0.03, v/v/v)為流動相,在25～40 ℃條件下,測定了各對映體的k和α,再根據(jù)公式(1),對lnα～1/T作圖,計算了相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù),結(jié)果見表4。

表 4　4種β-受體阻滯劑對映體的熱力學(xué)參數(shù)Table 4　Thermodynamic parameters of the four β-blocker enantiomers

r2: correlation coefficient; ΔΔG0, ΔΔH0, ΔΔS0: the differences of Gibbs free energy change, enthalpy change, entropy change between stationary phase and mobile phase, respectively;T: thermodynamic temperature, K.

從表4可以看出,4種β-受體阻滯劑對映體在相應(yīng)溫度區(qū)域內(nèi)呈線性關(guān)系,說明在本實驗的范圍內(nèi)焓變之差和熵變之差為定值,對映體在該手性柱上的選擇機制不變;熱力學(xué)參數(shù)中,ΔΔH0表示兩對映體與固定相的作用強度之差,ΔΔS0表示自由度變化之差,也反映兩個對映體與手性選擇劑作用過程構(gòu)象匹配性的差別程度。若ΔΔH0和ΔΔS0均為負值,說明手性拆分為焓驅(qū)動,出峰較晚的異構(gòu)體較出峰較早的異構(gòu)體與固定相間的相互作用力更強,且與固定相形成絡(luò)合物后分子總體變得更有序,溫度升高選擇因子下降[21]。由表4可知,4種β-受體阻滯劑對映體的ΔΔH0和ΔΔS0均為負值,說明它們的手性拆分均為焓驅(qū)動過程;4種藥物對映體分離過程的ΔΔG0均為負值,且依次按卡維地洛、阿羅洛爾、美托洛爾、普萘洛爾的順序增大,這與它們在Chiralpak AD-H色譜柱上的分離度大小順序一致,即卡維地洛分離度最大,而普萘洛爾分離度最小。

2.7.2Chiralpak AD-H手性固定相的拆分作用

多糖衍生物類手性固定相的拆分機理較為復(fù)雜,目前尚不完全明確。多數(shù)研究認為在直鏈淀粉分子中,極性的氨基甲酸酯基團和3,5-二甲基苯基圍繞主鏈形成一個螺旋溝槽,樣品分子通過調(diào)節(jié)構(gòu)象進入槽內(nèi),通過3種作用與固定相形成締合物:一是化合物結(jié)構(gòu)上的羰基與手性固定相上氨基甲酸酯基上的亞氨基之間的氫鍵作用,或化合物的亞氨基、羥基等與手性固定相上羰基之間的氫鍵作用;二是化合物結(jié)構(gòu)上的羰基與手性固定相上氨基甲酸酯基殘基上的羰基之間的偶極-偶極作用;三是化合物結(jié)構(gòu)上的苯環(huán)與手性固定相上的苯環(huán)之間的π-π作用。對映體通過與固定相之間作用形成締合物的穩(wěn)定性差異來實現(xiàn)拆分;擁有芳香基團的化合物由于可將其芳香基團插入手性固定相空穴中,形成穩(wěn)定的非對映異構(gòu)體締合物而實現(xiàn)拆分[29-31]。

在本研究中4種β-受體阻滯劑化合物具有相同的手性中心,手性碳原子附近的羰基、羥基和亞氨基都可與手性固定相上氨基甲酸酯基上的亞氨基或羰基相互作用。研究結(jié)果顯示,普萘洛爾的保留最弱,可能是因其結(jié)構(gòu)上有一個萘環(huán),空間位阻較大,削弱了其與手性固定相間的作用;卡維地洛的保留最強,可能是因其結(jié)構(gòu)中多個芳香基團進入手性固定相孔穴中,形成了穩(wěn)定的締合物,從而保留增強。美托洛爾和阿羅洛爾分子中也含有多個可與手性固定相發(fā)生氫鍵作用、偶極-偶極作用和π-π作用的基團,因此也可在Chiralpak AD-H色譜柱上實現(xiàn)手性拆分。

3　結(jié)論

本研究首次應(yīng)用直鏈淀粉衍生物型手性固定相,在正相色譜條件下,系統(tǒng)地考察了流動相組成、流速和柱溫等因素對普萘洛爾、美托洛爾、阿羅洛爾和卡維地洛4種對映體分離的影響,建立了能同時拆分4種β-受體阻滯劑對映體的HPLC-MS/MS手性定量分析方法,并從熱力學(xué)研究及對映體結(jié)構(gòu)分析的角度對拆分機理進行探討。該方法簡便，重復(fù)性好,具有快速高效拆分的優(yōu)勢,尤其是成功拆分了阿羅洛爾對映體,為β-受體阻滯劑對映體的質(zhì)量控制和生物樣品分析研究提供了技術(shù)支持。

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Special issue on celebration of International Working Women’s Day (2018) by female chromatographic scientists·Article