寶山堇菜Pb耐性相關(guān)基因篩選及表達(dá)特性*

鄧冬梅，艾紅霞，鄧金川，廖斌

(1. 廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院∥廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006；2. 中山大學(xué)生態(tài)進(jìn)化學(xué)院∥生物防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥廣東植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510275)

超富集植物(hyperaccumulator)是指能夠超量吸收重金屬(或非金屬)并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部分貯藏起來(lái)的植物，在重金屬污染土壤的植物修復(fù)中有重要應(yīng)用潛力[1]。深刻探討超富集植物對(duì)重金屬的耐性和富集基因，對(duì)進(jìn)一步利用基因技術(shù)提高重金屬污染土壤植物修復(fù)效率有重要意義[2]。相對(duì)于其他重金屬，在分子水平上對(duì)Pb超富集機(jī)理的探索很少[3]。

寶山堇菜Violabaoshanensis是我國(guó)發(fā)現(xiàn)的一種Cd超富集植物[4 - 5]，也具有較強(qiáng)的Pb耐性和富集能力[6]，因此，寶山堇菜為重金屬富集、耐性相關(guān)基因的研究提供了豐富的基因資源。但目前，基本沒(méi)有在分子水平上對(duì)寶山堇菜的Pb超富集機(jī)理的探索。

就發(fā)現(xiàn)與某一性狀相關(guān)基因的方法來(lái)講，抑制差減雜交(SSH)被認(rèn)為是一種較為適合的技術(shù)，可在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)現(xiàn)兩材料間差異表達(dá)的基因[7]。據(jù)此，本研究利用SSH技術(shù)篩選寶山堇菜根在Pb脅迫下特異表達(dá)的EST(Expressed Sequence Tags)基因克隆片段，并選擇部分克隆片段分別進(jìn)行半定量RT-PCR和Northern雜交分析驗(yàn)證其表達(dá)特征，為從分子水平揭示寶山堇菜對(duì)Pb的耐性和富集機(jī)理提供參考。

1　材料與方法

1.1　植物材料

以組織培養(yǎng)獲得的無(wú)菌寶山堇菜為材料，選取大小一致，根系發(fā)達(dá)的無(wú)菌苗，流水洗去根表面瓊脂，于1/2 Hogland營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)2周后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2　寶山堇菜SSH文庫(kù)構(gòu)建

1.2.1 RNA提取和cDNA合成對(duì)預(yù)培養(yǎng)2周的寶山堇菜進(jìn)行300 μmol/L Pb(NO3)2處理，并設(shè)立不加Pb的對(duì)照處理。處理2 d后，用Trizol方法提取兩個(gè)處理寶山堇菜根中的RNA，并利用OligotexTM mRNA純化試劑盒(QiaGen公司)分離RNA中的mRNA，利用Super SMARTTM cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Clontech公司)合成cDNA，并利用QIAquick PCR Purification Kit(QiaGen公司)純化合成的cDNA。

1.2.2SSH差減雜交以Pb處理的cDNA為tester，以不加Pb對(duì)照處理為driver，利用PCR-Select cDNA Subtraction Kits(Clontech公司)構(gòu)建SSH文庫(kù)。首先對(duì)tester和driver進(jìn)行RsaI酶切，等分成兩份，分別連接上不同接頭，而Driver cDNA不連接頭。連有不同接頭的Tester cDNA分別與過(guò)量的Driver cDNA混合，進(jìn)行兩次差減雜交。

1.2.3差異cDNA文庫(kù)建立及序列分析以雜交產(chǎn)物為模板，以接頭1和2R設(shè)計(jì)的巢式引物為引物，進(jìn)行兩次抑制PCR。將2種雜交的PCR產(chǎn)物分別克隆至pGEM-T vector(Promaga公司)中，建立差異cDNA文庫(kù)。將有效克隆的菌液送去上海英竣公司測(cè)序，得到每個(gè)克隆的EST序列，所有的ESTs在NCBI的網(wǎng)站上(http∥www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行比對(duì)。

1.3　寶山堇菜Pb特異表達(dá)基因檢測(cè)

1.3.1植物處理及RNA提取對(duì)預(yù)培的寶山堇菜無(wú)菌苗分別進(jìn)行不同濃度(0、60、300、600 μmol/LPb (NO3)2，處理2 d)和時(shí)間(0、1、2、7 d，處理濃度300 μmol/L Pb (NO3)2)的Pb處理，及不同脅迫處理(300 μmol/LCdSO4，100 mmol/L NaCl和φ=37%的H2O2，處理1 d)。處理結(jié)束后，利用2.2中方法提取各處理寶山堇菜根和葉片中RNA。

表1　PS10、PS13號(hào)EST克隆片段及18S rRNA RT-PCR特異引物Table 1　Primer sequences of RT-PCR of PS10, PS13 gene clone, and 18S rRNA

1.3.2半定量PCR利用OmniscriptTMReverse Transcriptase(QiaGen公司)合成cDNA第一鏈。以寶山堇菜體內(nèi)18S rRNA擴(kuò)增片斷為內(nèi)參。為研究PS10和PS13號(hào)EST克隆片段在寶山堇菜中的表達(dá)特性，利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)18S rRNA及PS10和PS13號(hào)EST克隆片段上下游擴(kuò)增特異引物(表1)，并利用設(shè)計(jì)引物進(jìn)行半定量PCR。

反應(yīng)體系(25 μL)包括: ExTaq酶mix 19 μL，cDNA第一鏈模板2.0 μL，上下游引物各2 μL。PCR溫度程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)28次，最后72 ℃終延伸7 min，4 ℃保存。PCR樣品進(jìn)行w=2%瓊脂糖膠電泳，目的條帶與18S rRNA條帶的強(qiáng)度比代表了目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4　Northern 印跡轉(zhuǎn)移

對(duì)2.1中提取的各處理的RNA進(jìn)行w=1.2%瓊脂糖電泳，電泳完畢后，將RNA從凝膠轉(zhuǎn)移到帶正電的尼龍膜上，并通過(guò)紫外交聯(lián)固定于膜上。

提取需要檢測(cè)的克隆片段的質(zhì)粒DNA，然后采用SSH技術(shù)中的第一次PCR的程序進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后作為探針模板。同時(shí)利用Oligo-labelling Kit(TaKaRa公司)進(jìn)行【α-32P】dCTP探針制備。將轉(zhuǎn)接有RNA的尼龍膜在42 ℃預(yù)雜交4 h后，加入5 μL已標(biāo)記好的探針，42 ℃下進(jìn)一步雜交16 h，然后洗去未雜交探針，壓入磷屏進(jìn)行放射自顯影，在臺(tái)風(fēng)(Typhoon)儀器上讀取磷屏數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果與討論

2.1　RNA、cDNA及文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)照與Pb處理下寶山堇菜根中的RNA電泳可看到28S rRNA 和18S rRNA的清晰條帶，無(wú)托尾現(xiàn)象，并且28S rRNA條帶近乎是18S rRNA條帶寬度的2倍，另外看不到基因組DNA以及蛋白污染(圖1)，說(shuō)明提取的RNA質(zhì)量較好，無(wú)降解。

圖1　寶山堇菜對(duì)照和300 μmol/L Pb處理根中總RNA1.CK；2.300 μmol/L Pb2+Fig.1　Total RNA of control and 300 μmol/L Pb in V. baoshanensis root 1. CK; 2. 300 μmol/L Pb2+

圖2　寶山堇菜cDNA合成及RsaⅠ酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)Fig.2　Double strand cDNA syntheses of V. baoshanensis and its Rsa Ⅰ digestion 1和2分別為對(duì)照和Pb處理的雙鏈cDNA；3和4分別為對(duì)照和Pb處理的酶切產(chǎn)物

圖3　SSH文庫(kù)部分克隆質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物Fig.3　PCR detection of partial clone plamid of SSH library 1-11： the PCR product of clone plasmid

寶山堇菜對(duì)照和Pb處理的雙鏈cDNA分布在0.2～2 kb之間，在0.5～1 kb之間的豐度較高，說(shuō)明雙鏈cDNA的完整性有保證，能充分代表mRNA在片段分布及豐度上的特點(diǎn)。而RsaI酶切產(chǎn)物的分布范圍為0.1～1 kb，最高豐度在500 bp左右，分布范圍明顯縮小，說(shuō)明酶切效果明顯(圖2)。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，文庫(kù)中絕大部分克隆含有插入片段，片段大小介于150～1 000 bp之間，平均的插入片段大小約500 bp左右(圖3)。

2.2　EST測(cè)序分析

檢索結(jié)果顯示隨機(jī)測(cè)序的140個(gè)克隆代表40個(gè)獨(dú)立片段，片段大小在120～890 bp之間，有27個(gè)獨(dú)立片段與已知基因有同源性(表2)，它們?cè)诩?xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程中有著很廣泛的作用，根據(jù)其功能分為5類：① 抗氧化酶類；② 脅迫蛋白類；③ 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類；④ 代謝相關(guān)；⑤ 其它功能待確定cDNA(表2)。這些與EST克隆片段同源性較高的基因很多也為重金屬脅迫、解毒相關(guān)基因，如IIB型Ca-ATP酶(type IIB calcium ATPase)[8 - 9]，泛素延長(zhǎng)蛋白(ubiquitin extension protein)[10 - 11]，金屬硫蛋白基因(putative metallothionein-like protein (Mt2) mRNA)[12 - 13]等，另外還有一些與其他脅迫相關(guān)的基因，如：琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)[14 - 15]，磷酸甘油酸變位酶(phosphoglyceromutase)[16 - 17]。說(shuō)明寶山堇菜對(duì)Pb脅迫的響應(yīng)也有很多脅迫相關(guān)基因表達(dá)，且不是一個(gè)簡(jiǎn)單的調(diào)控過(guò)程，而是一個(gè)整體層面的反應(yīng)。

表2　利用SSH技術(shù)篩選出的差異表達(dá)克隆在GeneBank中的核酸同源性比較結(jié)果Table 2　Blastn results of the different expressed clones via SSH comparing with the genes in GeneBank

圖4　PS10號(hào)和PS13號(hào)克隆的RT-PCR半定量分析Fig.4　RT-PCR analysis of the expression of the PS10 and PS13 clone

2.3　半定量RT-PCR和Northern雜交分析

文庫(kù)中和Sesamumindicum木質(zhì)素轉(zhuǎn)糖基酶(xyloglucan endotransglycosylase, XTH)基因同源的PS10號(hào)EST克隆片段在Pb脅迫下寶山堇菜根和葉中均屬上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量隨脅迫濃度增加先升高，在300 μmol/L Pb最高，脅迫濃度繼續(xù)升高時(shí)表達(dá)量略有下降，此外該克隆片段表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，但對(duì)其他脅迫響應(yīng)不太明顯(圖4，圖5)。木質(zhì)素轉(zhuǎn)糖基酶催化木質(zhì)素的水解，受赤霉素GA3等植物激素調(diào)節(jié)，在細(xì)胞壁延伸和重建過(guò)程中起作用[18]。在菟絲子侵染、干旱、低溫和高鹽脅迫和蚜蟲(chóng)噬咬下，該基因都有表達(dá)[19 - 20]。Krzesowska等[21]研究表明細(xì)胞壁的增厚是很多植物對(duì)Pb脅迫的主要響應(yīng)方式。擬南芥屬、雜交白楊和浮萍等不同植物在收到Pb脅迫后都出現(xiàn)細(xì)胞壁的增厚，以將更多的Pb固定在細(xì)胞壁上。寶山堇菜中，木質(zhì)素轉(zhuǎn)糖基酶的上調(diào)表達(dá)是否和此過(guò)程相關(guān)需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)解釋。但木質(zhì)素轉(zhuǎn)糖基酶基因?qū)ζ渌{迫沒(méi)有明顯響應(yīng)說(shuō)明不同植物對(duì)脅迫的響應(yīng)機(jī)制是不相同的。

圖5　PS10號(hào)克隆的Northern分析Fig.5　Northern hybridization of the PS10 clone

文庫(kù)中PS13號(hào)克隆片段和GTP結(jié)合蛋白(GTP binding mRNA)同源性很高。GTP結(jié)合蛋白可能在Ca離子，茉莉酸(JAs)和水楊酸(SA)等介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起到重要的作用，為細(xì)菌侵染和高溫等脅迫下的響應(yīng)基因[22 - 23]。JAs和SA介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑與植物抗性密切相關(guān)，且JAs的積累也和重金屬Cu和Cd的抗性有關(guān)[24]。但GTP結(jié)合蛋白和Pb脅迫間的直接相關(guān)關(guān)系目前還沒(méi)有報(bào)道。PS13號(hào)EST克隆片段隨Pb脅迫濃度的增加，表達(dá)量逐漸增加，在600 μmol/L Pb時(shí)達(dá)到最大。在葉中，該片段表達(dá)量的變化和Pb脅迫濃度增加無(wú)明顯關(guān)系。300 μmol/L Pb脅迫下，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，寶山堇菜根和葉中該片段的表達(dá)量也逐步上升，處理時(shí)間為7 d時(shí)表達(dá)量最大。對(duì)其他脅迫，該片段在寶山堇菜根和葉中的變化基本不明顯，Na脅迫下，在寶山堇菜葉中表達(dá)量略有增加(圖4、圖6)。這說(shuō)明，寶山堇菜根中，Pb脅迫下，GTP結(jié)合蛋白基因可能是上調(diào)表達(dá)基因，GTP結(jié)合蛋白可能參與Pb脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)，其作用方式需進(jìn)一步研究。

圖6　PS13號(hào)克隆的Northern分析Fig.6　Northern hybridization of the PS13 colone

3　結(jié)　論

1)利用SSH技術(shù)篩選得到27個(gè)在Pb脅迫下特異表達(dá)的EST基因克隆片段，這些基因在植物體內(nèi)執(zhí)行多種功能，說(shuō)明寶山堇菜對(duì)Pb脅迫的響應(yīng)是一個(gè)整體層面的靈敏反應(yīng)。

2)半定量RT-PCR和Northern雜交分析表明，與GTP結(jié)合蛋白、木葡聚糖內(nèi)源轉(zhuǎn)糖基酶基因相似性高的2個(gè)克隆片段在寶山堇菜根中為Pb脅迫上調(diào)表達(dá)基因。Pb脅迫下，木葡聚糖內(nèi)源轉(zhuǎn)糖基酶可能參與寶山堇菜在Pb脅迫下的生理調(diào)節(jié)反應(yīng)，而GTP結(jié)合蛋白可能直接參與寶山堇菜體內(nèi)Pb脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)。

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