哮喘動(dòng)物模型建立的研究進(jìn)展

張睦涵 朱振剛

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)(2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，天津 300193)

支氣管哮喘(bronchial asthma)簡(jiǎn)稱“哮喘”，是一種由多種細(xì)胞組分及復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)參與的，對(duì)過(guò)敏性與非過(guò)敏性因素做出特異性反應(yīng)的一種慢性氣道炎癥性疾病，被認(rèn)為是造成醫(yī)療衛(wèi)生高負(fù)擔(dān)的臨床最常見(jiàn)的慢性病之一[1]。哮喘防治的關(guān)鍵在于對(duì)哮喘發(fā)病各環(huán)節(jié)分子機(jī)制的深入研究，從而從病因?qū)W、基因水平研制出針對(duì)哮喘的靶向治療藥物，而新藥研究都需要進(jìn)行前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此建立與人類哮喘病理生理及臨床變化高度擬合的哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型一直是哮喘實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)和中心環(huán)節(jié),因此筆者查閱了最近10年有關(guān)哮喘動(dòng)物建模及評(píng)價(jià)方面的有關(guān)文獻(xiàn)，從模型動(dòng)物選擇及哮喘模型類型兩方面總結(jié)哮喘動(dòng)物模型的研究進(jìn)展，期望對(duì)哮喘的臨床及實(shí)驗(yàn)研究有所裨益。

1 模型動(dòng)物

1.1 小鼠

小鼠作為模型動(dòng)物廣泛應(yīng)用于人類多個(gè)系統(tǒng)的疾病研究中。小鼠的基因組背景純凈，品系豐富，生物學(xué)試劑及抗體完備且性價(jià)比高,可復(fù)制出哮喘經(jīng)典的氣道高反應(yīng)、氣道慢性炎癥、黏液增多等癥狀，有文獻(xiàn)報(bào)道成功復(fù)制小鼠氣道重構(gòu)模型.故其雖有體積小，操作及取材較困難，造模需要多次致敏和激發(fā)等缺點(diǎn)，目前仍為支氣管哮喘研究最為常用的動(dòng)物模型。常用的小鼠品系為BALB/c、C57BL/6，A/J、CBA、C3H等，以前兩種品系最常用。

1.2 大鼠

大鼠應(yīng)用于哮喘造模研究不如小鼠充分，因?yàn)槠潆m然也有品系純，來(lái)源廣，價(jià)格較便宜等優(yōu)點(diǎn)，且分子生物學(xué)試劑較多，標(biāo)本采集量遠(yuǎn)比小鼠充足，對(duì)致敏原激發(fā)反應(yīng)較為一致，能出現(xiàn)與人類哮喘類似的速發(fā)相及遲發(fā)相變態(tài)反應(yīng)，但大鼠模型在模擬人類哮喘嗜酸細(xì)胞脫顆粒等關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)上差異較大，故目前對(duì)應(yīng)用大鼠建立哮喘動(dòng)物模型的科學(xué)性上存在較大爭(zhēng)議。

1.3 豚鼠

豚鼠哮喘模型是最早及最經(jīng)典的動(dòng)物哮喘模型，在1976年就有應(yīng)用卵清蛋白(OVA)建立豚鼠哮喘模型的報(bào)道[2]，后來(lái)隨著研究的深入文獻(xiàn)報(bào)道很多，Ressmever等[3]也認(rèn)為豚鼠在氣道藥理模型上比大鼠及小鼠更合適。但應(yīng)用豚鼠建立哮喘動(dòng)物模型的缺點(diǎn)也是顯而易見(jiàn)的。豚鼠的相關(guān)生物學(xué)抗體較少，敏感性強(qiáng)，個(gè)體反應(yīng)差異大，導(dǎo)致出現(xiàn)不致敏或過(guò)度反應(yīng)死亡的情況，影響造模成功率，且豚鼠價(jià)格較小鼠和大鼠而言較為昂貴，會(huì)導(dǎo)致研究成本的增加，故近年來(lái)豚鼠用于支氣管哮喘建模有逐步減少的趨勢(shì)。試驗(yàn)豚鼠多數(shù)研究選擇雄性豚鼠，鼠齡25～35 d，體質(zhì)量150～250 g，造模方法一般為：實(shí)驗(yàn)第1 d腹腔注射10% OVA 1 mL致敏，2周后以1% OVA霧化激發(fā)誘喘，每日1次直至哮喘典型癥狀出現(xiàn)。李海銀等[4]應(yīng)用OVA聯(lián)合弗氏佐劑致敏豚鼠建立了中性粒細(xì)胞哮喘的豚鼠模型。

1.4 其他動(dòng)物

除目前常用的大鼠、小鼠、豚鼠外還有一些相對(duì)大型的動(dòng)物可以選擇，例如貓可發(fā)生類似于人類慢性哮喘的支氣管疾病; 馬可以形成以中性粒細(xì)胞升高為主的呼吸道疾病，它有哮喘的一些特點(diǎn)，可能與慢性阻塞性肺疾病的聯(lián)系更加密切；已知羊和犬對(duì)某些變應(yīng)原天生就敏感[5]，猴的免疫系統(tǒng)和人非常相似，但是存在動(dòng)物來(lái)源及實(shí)驗(yàn)成本的限制，研究與應(yīng)用都相對(duì)較少。

2 模型類型

2.1 過(guò)敏性哮喘模型

過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型是目前研究最廣泛，也是與人類哮喘病理生理機(jī)制最接近的哮喘模型類型。過(guò)敏性哮喘的造模劑常有卵清蛋白、花粉和有機(jī)粉塵等，其中卵清蛋白致敏研究最充分，模型最成熟，不再贅述。季節(jié)性哮喘的誘因主要是花粉和真菌蛋白等致敏，建立此類模型對(duì)研究變應(yīng)性哮喘有很大意義。李雅莉等[6]應(yīng)用蓬草花粉粗浸液致敏激發(fā)的BALE /C小鼠建模，具體方法為:首先于第一天腹腔注射300μg蓬草花粉粗浸液加氫氧化鋁凝膠2 mg致敏，之后第7、14天后加強(qiáng)致敏，第24天給予30 μL(10 g/L)蓬草花粉粗浸液滴鼻激發(fā)，每日1次，連續(xù)5次激發(fā)。在有機(jī)粉塵致敏方面，應(yīng)用于誘發(fā)支氣管哮喘模型研究較多的是屋塵螨及蟑螂。最近國(guó)外相關(guān)屋塵螨所致哮喘模型的建立方法都是以鼻內(nèi)滴入屋塵螨3～6周[7-8]，朱艷芬等[9]研究了不同濃度致敏激發(fā)下小鼠支氣管哮喘氣道重構(gòu)模型，其存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系及時(shí)效關(guān)系，結(jié)果顯示高濃度屋塵螨提取物處理9周時(shí)氣道重構(gòu)表現(xiàn)最為明顯。

2.2 感染性哮喘模型

感染性哮喘的經(jīng)典模型是應(yīng)用呼吸道合胞病毒(respiratory syncyialvirues，RSV)，內(nèi)毒素、脂多糖等致敏。蔣雄斌等[10]研究表明，RSV感染可致OVA致敏激發(fā)的哮喘小鼠呼吸道炎癥明顯加重，氣道高反應(yīng)性及其時(shí)間明顯延長(zhǎng)。張雷英等[11]研究了時(shí)期因素對(duì)哮喘模型的影響，發(fā)現(xiàn)致敏前感染RSV明顯抑制OVA誘導(dǎo)的肺部炎癥，但致敏后感染RSV則對(duì)OVA誘發(fā)的氣道變態(tài)炎癥無(wú)明顯影響。Newcomb等[12]則發(fā)現(xiàn)IL-17 A基因敲除的小鼠比野生小鼠在經(jīng)OVA及RSV致敏激發(fā)的過(guò)程中表現(xiàn)出了更強(qiáng)烈的氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥癥狀。

2.3 職業(yè)性哮喘模型

職業(yè)性哮喘的定義是由工作場(chǎng)所特定的環(huán)境因素所誘發(fā)的哮喘病癥，其臨床癥狀和其他哮喘類型相似，表現(xiàn)為可逆的氣道阻塞，非特異性氣道高反應(yīng)性。流行病學(xué)調(diào)查認(rèn)為哮喘發(fā)病率上升和過(guò)去數(shù)十年工業(yè)化進(jìn)程加速導(dǎo)致的職業(yè)暴露密切相關(guān)。而各種各樣的環(huán)境因素，特別是大量的富含可吸入蛋白的人造化合物和環(huán)境污染物，被認(rèn)為是導(dǎo)致職業(yè)性哮喘的主要誘因[13]。有證據(jù)表明環(huán)境抗原能造成非特異性血清IGE升高，這被認(rèn)為和其引起的哮喘癥狀相關(guān)。Tarkowski等人用2.0 mg/m3的氣態(tài)甲醛預(yù)處理BALB/C小鼠10 d，每天6 h，小鼠產(chǎn)生的血清(其他過(guò)敏原)特異性IGE較未處理組抗體含量提高3倍。

2.4 肥胖哮喘模型

隨著國(guó)民飲食結(jié)構(gòu)的嬗變，肥胖人群比重不斷上升，相關(guān)健康問(wèn)題也引起學(xué)術(shù)界注意。肥胖在哮喘發(fā)生、發(fā)展中的作用逐漸受到重視[14-15],2006版GINA將高體塊指數(shù)列為哮喘的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。國(guó)外多采用基因缺陷或高脂飲食誘導(dǎo)建立肥胖動(dòng)物哮喘模型，以進(jìn)行相關(guān)研究[16]。但人類多為單純性肥胖引起哮喘癥狀，故前者有一定局限，而后者所用純化配方飼料具有造價(jià)高的問(wèn)題[17]。我國(guó)學(xué)者夏宇和黃英[15]采用不含致敏原的自制高脂飼料喂養(yǎng)、卵清蛋白致敏激發(fā)C57BL/6 J小鼠，成功建立了肥胖哮喘動(dòng)物模型。

2.5 中性粒細(xì)胞性哮喘模型

嗜酸細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的中心地位已廣為人知，然而最近的研究提示中性粒細(xì)胞(neutrophil,NEU)在哮喘炎癥浸潤(rùn)過(guò)程中也有重要影響。Douwes等[18]發(fā)現(xiàn)約50%的哮喘患者存在氣道NEU浸潤(rùn)，且NEU與重癥哮喘[19]、遲發(fā)型哮喘[20]、激素不敏感型哮喘[21]有密切聯(lián)系。2006年Simpson 等[22]將誘導(dǎo)痰中中性粒細(xì)胞百分比(NEU%)>61%的哮喘患者定義為中性粒細(xì)胞哮喘(neutrophilicasthma,NA)。諸多學(xué)者從各個(gè)方面嘗試復(fù)制中性粒細(xì)胞哮喘動(dòng)物模型。迄今為止，OVA是制備中性粒細(xì)胞哮喘動(dòng)物模型最常用的致敏原，有單純OVA和復(fù)合OVA(含佐劑)兩種，以復(fù)合OVA較常用。除了致敏原以外，細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)[23]、環(huán)境污染[24]、香煙煙霧[25]、支原體感染[26]等許多非過(guò)敏性因素也可導(dǎo)致哮喘患者或小鼠氣道NEU增多，活性增強(qiáng)，并與AHR有關(guān)，因此通常采用OVA聯(lián)合非過(guò)敏因素建立中性粒細(xì)胞哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

2.6 難治性哮喘模型

哮喘患者中有一組人群，我們稱之為難治性哮喘。這里所說(shuō)的難治，并不是說(shuō)所有嚴(yán)重的，甚至危及生命的哮喘類型，而是指當(dāng)使用最大推薦劑量的吸入治療后，仍未有效地控制的哮喘。難治性哮喘約占整個(gè)哮喘人群的20%。但這類人群所花費(fèi)的費(fèi)用占整個(gè)哮喘人群的80%[27]。關(guān)于難治性哮喘模型的復(fù)制目前尚無(wú)權(quán)威方案。徐世軍等認(rèn)為過(guò)敏性豚鼠哮喘模型結(jié)合變應(yīng)原反復(fù)刺激造模、過(guò)敏性豚鼠哮喘模型結(jié)合反復(fù)呼吸道感染造模、過(guò)敏性豚鼠哮喘模型結(jié)合呼吸道合胞病毒等病毒感染造模及過(guò)敏性與運(yùn)動(dòng)性哮喘相結(jié)合造模等思路有望成功復(fù)制難治性哮喘模型。

2.7 哮喘氣道重塑模型

氣道重塑是哮喘慢性化后面臨的重要問(wèn)題，和激素抵抗、哮喘反復(fù)發(fā)作、哮喘-慢阻肺綜合征等相關(guān)。哮喘氣道重塑是一個(gè)不斷發(fā)展的過(guò)程，從炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到氣道內(nèi)腺體的增殖和肥大，最終導(dǎo)致基底膜和氣道平滑肌增厚，引起不可逆性氣流受限和非特異性的氣道高反應(yīng)性[28]。氣道重塑的發(fā)生代表哮喘病程從炎癥性病變到結(jié)構(gòu)改變的轉(zhuǎn)化趨勢(shì)，目前來(lái)看涉及分子機(jī)制較為復(fù)雜，是哮喘研究的挑戰(zhàn)之一[29]。因此復(fù)制與人類哮喘氣道重塑病理特征相似的動(dòng)物模型也是哮喘實(shí)驗(yàn)研究的重要組成。陳寶生等[30]以雄性豚鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)卵清蛋白腹腔注射致敏霧化吸入激發(fā)的方法復(fù)制哮喘氣道重塑動(dòng)物模型。采用連續(xù)10周霧化的長(zhǎng)程干預(yù)措施后發(fā)現(xiàn)豚鼠出現(xiàn)血氧分壓降低，提示氣道重塑模型復(fù)制成功。

2.8 激素抵抗型哮喘模型

隨著糖皮質(zhì)激素在臨床上的廣泛應(yīng)用，以及環(huán)境、精神、心理等因素的影響，部分哮喘患者哮喘癥狀反復(fù)發(fā)作，并對(duì)糖皮質(zhì)激素的敏感度明顯降低，因此一種新的哮喘類型-激素抵抗型哮喘(steroid resistant asthma，SRA)也得到廣泛的關(guān)注，建立SRA動(dòng)物模型的方法也在積極的研究中[31]。研究人員發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的抗原暴露、激素治療不合理中斷可影響支氣管哮喘的控制[32-33]。文莎和吳峰[34]通過(guò)普通級(jí)BALB/C雌性小鼠采用卵清白蛋白(OVA)致敏、激發(fā)造模，予地塞米松干預(yù)并連續(xù)霧化9周，結(jié)果成功復(fù)制激素抵抗型小鼠哮喘模型，說(shuō)明反復(fù)抗原刺激聯(lián)合地塞米松中斷性干預(yù)建立小鼠SRA模型的方法切實(shí)可行。

3 結(jié)語(yǔ)

基于近十年國(guó)內(nèi)外支氣管哮喘動(dòng)物造模方面相關(guān)研究可以發(fā)現(xiàn)，小鼠是哮喘動(dòng)物模型建立中最常使用的動(dòng)物。過(guò)敏性哮喘是被最充分復(fù)制的哮喘模型，其病理生理學(xué)變化研究最為充分。卵清蛋白致敏、激發(fā)是最常用的哮喘造模方法。不少學(xué)者也注意到支氣管哮喘疾病本身的異質(zhì)性，激素抵抗哮喘、中性粒細(xì)胞哮喘等基于哮喘表型的分類方法也影響了哮喘動(dòng)物模型的研究。哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究趨于細(xì)化，對(duì)哮喘氣道重塑、難治性哮喘的動(dòng)物模型研究也從無(wú)到有。隨著有機(jī)粉塵暴露的增加，越來(lái)越多的職業(yè)相關(guān)性哮喘動(dòng)物模型被成功復(fù)制。今后的哮喘動(dòng)物模型研究必將沿著與臨床更加緊密、結(jié)合哮喘表型、結(jié)合基因工程學(xué)研究的道路不斷前進(jìn)。