核磁共振技術在植物研究中的應用進展

韋 丹，李 濤，鄒顯花，陳思同，蔡一冰，馬祥慶

(1.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350002； 2.國家林業(yè)局杉木工程技術研究中心，福建 福州 350002)

核磁共振現(xiàn)象最早于20世紀40年代美國斯坦福大學的F.Bloch教授和哈佛大學的EM.Purcell教授等人用不同的方法觀察到[1]。核磁共振的基本原理是將物體置于特殊的磁場中，用無線電脈沖激發(fā)物體內(nèi)某一原子核(如13C、1H、17O、14N、31P)，使原子核發(fā)生能級分裂，當物質吸收到外來電磁輻射時，一些具有磁性的原子核在外磁場的作用下吸收一定波長的無線電波而發(fā)生共振吸收，從低能態(tài)躍遷至高能態(tài)，產(chǎn)生核磁共振現(xiàn)象，其吸收峰頻率對吸收峰強度作圖即為核磁共振波譜圖[2]。

自核磁共振現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)以來，核磁共振已成為測定物質結構的強有力工具，不但能夠實現(xiàn)被檢測植物樣品內(nèi)部結構和代謝產(chǎn)物的可視化，還可以分析被測活體植物體內(nèi)的重要生理過程，因此這一技術被廣泛應用于植物生理和發(fā)育、生物多樣性、基因功能以及代謝作用等的眾多研究領域[3]。但近年來，關于核磁共振技術相關的綜述性報道多限于土壤和水體，對在植物研究中的報道尚不多見。鑒于此，本文將從核磁共振磷譜、氫譜、碳譜3個方面分別論述其在植物研究中的應用，旨在為相關學者了解核磁共振技術在植物科學中的應用提供科學素材。

1 核磁共振磷譜(31P-NMR)

核磁共振磷譜是磷原子的化學位移和與它相鄰的氫原子裂分時偶合常數(shù)值隨著化學環(huán)境的變化而不同，且在31P-NMR圖譜中只對磷原子有信號響應，產(chǎn)生的信號強度與31P的數(shù)量成正相關，因此可對樣品定性定量分析，能準確迅速地檢測含磷化合物。31P-NMR不受其他元素干擾，分辨率高，可以廣泛應用于測定植物、土壤等復雜樣品中存在的多種形態(tài)的磷[4]。

1.1 31P-NMR在植物體內(nèi)磷分級研究中的應用

31P-NMR前處理較簡單，能夠檢測出樣品中所有含磷化合物，并且根據(jù)振動頻率不同分析各磷化合物形態(tài)。通過31P-NMR分析，正磷酸鹽、磷酸單酯、磷酸二酯(磷酯和DNA)、焦磷酸鹽和多磷酸鹽等已被成功檢測[5]。大量研究表明，植物中的磷主要以正磷酸鹽和磷酸單酯2種形態(tài)存在，例如球莖草與三葉草中正磷酸鹽占40%～60%[6]，小麥根系殘體降解過程中釋放的正磷酸鹽占90%[7]。植物體內(nèi)正磷酸鹽的大量存在是因為其吸收的磷多以正磷酸鹽的形式存在于植物液泡中。馮偉瑩等[8]在31P-NMR圖譜中發(fā)現(xiàn)湖泊水生植物和藻類中的有機磷(Po)主要以磷酸單酯為主，其平均含量分別占92%和83%。Ebuele等[9]通過31P-NMR研究罌粟、茴香、芥菜和芝麻籽種子特征，發(fā)現(xiàn)茴香種子正磷鹽濃度最高，為41.7%，其次是芥菜和芝麻籽，分別為9.3%和6.9%，在茴香和罌粟種子中檢測到少量的焦磷酸鹽，正磷酸二酯唯一存在于芝麻籽中，而磷酸鹽和多磷酸鹽均沒有檢測到。管宏友等[10]以油菜、蠶豆為研究對象，利用31P-NMR深入了解植物殘體中磷的分級情況，發(fā)現(xiàn)NaOH-EDTA萃取濃縮液中絕大部分是正磷酸鹽和磷酸單酯，分別占全磷比例的67%、28%；并且植物正磷酸鹽和磷酸單酯含量與全磷含量成正比。因此，31P-NMR技術能較好地研究植株體內(nèi)的磷分級情況并且是反映植株體內(nèi)供磷潛力的一種有力工具。

1.2 31P-NMR在植物細胞pH值研究中的應用

植物細胞內(nèi)pH是體現(xiàn)細胞代謝變化的一個重要參數(shù)，與植物中一些酶的活性緊密聯(lián)系[11]。在細胞內(nèi)磷庫施加強磁場后，其胞內(nèi)pH值與31P-NMR圖譜中的某些磷酸化合物共振峰的化學位移存在一定關系。31P-NMR測定pH可避免各種破壞所導致的細胞內(nèi)部生理和代謝變化以及由此產(chǎn)生的測定結果的不準確性。Espen等[12]采用31P-NMR研究玉米根中NO3-的吸收對細胞pH的影響，發(fā)現(xiàn)隨著NO3-濃度的增加，玉米根系中細胞pH降低，但在NO3-釋放過程中，根系細胞pH值的變化可由調(diào)控其細胞質膜H+-ATPase活性來實現(xiàn)。Stefanovic等[13]使用31P-NMR技術發(fā)現(xiàn)懸浮鈴木和擬南芥懸浮培養(yǎng)細胞在碳源存在的條件下，胞質和液泡中的pH值分別為7.40和5.20。劉于[14]通過31P-NMR研究磷饑餓脅迫條件下水稻根系細胞內(nèi)的pH變化，發(fā)現(xiàn)水稻根系組織中液泡總磷酸鹽峰最高；在長時間缺磷到恢復供磷過程內(nèi)，水稻根系組織細胞液泡及細胞質內(nèi)pH值的變化為先明顯下降后又恢復至原來的水平。以上研究利用31P-NMR技術測定植物細胞內(nèi)pH，不需要培養(yǎng)大量愈傷組織來獲得植物細胞，這為日后研究植物細胞內(nèi)pH值的差異及不同脅迫條件下的pH變化提供便捷有效的途徑。

1.3 31P-NMR在木素結構研究中的應用

木素(Lignin)是植物纖維的三大組分之一，其含量僅次于纖維素，約占植物纖維的三分之一。木素對植物生長具有重要作用，能夠與植物纖維中的碳水化合物生成木素-碳水化合物復合體。31P-NMR不僅彌補傳統(tǒng)木素研究方法對木素結構有破壞性且費時多等缺點，而且可以清晰地分辨出木素中的脂肪羥基、羧基和酚羥基等特征官能團[15]，這對于定量測定木素中的重要基團非常有利。劉玉等[16]根據(jù)31P-NMR譜圖得出三倍體毛白楊的原料木素中脂肪族羥基含量非常高，總酚羥基含量次之，羧基含量最低。董立斌[17]運用31P-NMR研究發(fā)現(xiàn)麥草燒堿蒽醌木素、玉米秸稈堿木素以及楊木、麥草混合硫酸鹽木素3種木素中脂肪族羥基含量均最高，羧基含量最低，玉米秸稈堿木素中的總酚羥基的含量和羧基含量均高于楊木、麥草混合硫酸鹽木素和麥草燒堿蒽醌木素?？偡恿u基主要由縮合型和非縮合型的愈創(chuàng)木基型、紫丁香基型和對羥苯基3種結構單元組成。王少光等[18]根據(jù)31P-NMR譜圖發(fā)現(xiàn)玉米全稈EAL木素主要由愈創(chuàng)木基型和對羥苯基2種結構單元組成，玉米秸稈皮質部木素則主要由對羥苯基組成。沈鋒等[19]利用31P-NMR定量分析木素各酚羥基功能基團，分析發(fā)現(xiàn)巨菌草EMAL中脂肪族羥基含量最高，酚羥基中非縮合型酚羥基含量較高，縮合型酚羥基含量次之，羧基含量最低。因此，運用31P-NMR可以分析不同木素的結構并確定功能基團的結構和差異，為以后木素結構的研究提供便利。

2 核磁共振氫譜(1H-NMR)

核磁共振氫譜(1H-NMR)是根據(jù)核磁共振儀記錄氫原子在共振下化學位移的變化而繪制的圖譜[20]，它可以獲取各種有機化合物和無機化合物的結構信息，是用于鑒定物質結構的重要方法之一。1H-NMR圖譜中相應信號的強弱反映了混合組分中特征化學成分的相對含量，具有單一性、全面性、定量性和易辨性等特點[21]，對于植物的定性定量研究具有極其深遠的意義。

2.1 1H-NMR在植物結構鑒定中的應用

1H-NMR圖譜中特征峰的數(shù)目反映了樣品中氫原子化學環(huán)境的種類；不同特征峰的高度比及強度比反映了不同化學環(huán)境氫原子的數(shù)目比。1H-NMR鑒定植物結構有其獨特的特點，它可以同時獲得各類質子化學的位移、數(shù)量、耦合關系等多個結構信息。例如，吳美玉等[22]使用1H-NMR法對19種前胡(PeucedanumL.)的乙醚提取物進行了快速的測試和解析，以鑒別真?zhèn)纹?，根?jù)所含特征化學成分香豆素母核的化學位移，鑒定出19種前胡中只有白花前胡(P.praeruptorumDunn.)和紫花前胡[P.decursivm(Miq.) Maxim]為藥品所示的正品前胡。秦海林等[23]采用核磁共振波譜儀測定了正品黃連樣品及黃連偽品的乙醇提取物的1H-NMR圖譜，發(fā)現(xiàn)黃連偽品沒有出現(xiàn)天麻的特征共振峰，但所有的正品黃連均出現(xiàn)這一信號。用1H-NMR法鑒別中藥植物的真?zhèn)?，具有快速、準確、重現(xiàn)性好、信息多等特點。

隨著檢測技術的不斷發(fā)展，二維和三維核磁共振技術也得到了廣泛應用。需要注意的是，在進行1H-NMR圖譜研究時，首先需要選擇適當?shù)奶崛》蛛x工藝，制備其特征總提取物；對其進一步分離，得到單體化合物后，通過鑒定和1H-NMR研究，對圖譜中的各個特征譜線進行歸屬，從而實現(xiàn)植物的結構鑒定。高效液相-核磁共振儀(HPLC-NMR)聯(lián)用技術是由液相色譜提供分離技術，核磁共振儀提供結構解析技術，從復雜的樣品中獲得單一組分的圖譜進行結構推測，解決了對于結構復雜樣品的鑒定困難問題。例如，鄒振興等[24]采用液相色譜—核磁共振聯(lián)用技術(HPLC-NMR)研究江南卷柏中的雙黃酮類成分，先利用色譜法對其進行系統(tǒng)的分離純化，再利用理化性質及多維核磁共振圖譜等手段對分離得到的單體化合物進行結構鑒定，從江南卷柏中分離鑒定出5個化合物。張沁凌等[25]利用結合1H-NMR和13C-NMR譜圖從海南核果木枝葉的正丁醇萃取物中鑒定分離得到11個化合物。邱蓉麗等[26]先采用反復硅膠柱層析、高壓制備液相色譜分離純化等方法分離喜熱靈芝實體的12個化合物，再運用1H-NMR技術從喜熱靈芝中鑒定出其結構。這都為后續(xù)核磁共振技術的標準化研究提供借鑒。

2.2 1H-NMR在植物代謝研究中的應用

核磁共振氫譜技術重現(xiàn)性好，對所有化合物的靈敏度一致，可同一批次檢測多種代謝物的同時，還能保證其結構信息的豐富性，并且圖譜中的信號峰強度與其濃度成正比，能直接根據(jù)相應濃度進行定量分析，這對于植物代謝物的研究意義重大。Ward等[27]采用核磁共振氫譜技術分析不同生態(tài)型擬南芥代謝物差異的相關性，在脂肪族物質和碳水化合物中均發(fā)現(xiàn)了差異，說明植物代謝物和生態(tài)型差異的相關性。Yang等[28]通過核磁共振氫譜技術對不同生長周期的共27個當歸(Angelicasinensis)樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)1H-NMR能夠清晰地反映出當歸植株不同生長時期相應的代謝產(chǎn)物變化。在進行核磁共振檢測過程中，有些基團中質子容易與溶劑發(fā)生化學變化甚至不含質子，使信號檢測不出，高效液相-核磁共振-質譜(HPLC-NMR-MS)聯(lián)用技術的出現(xiàn)彌補了這些不足，質譜可提供化合物的分子量，碎片峰包含了大量的結構信息。肖超妮等[29]采用液相色譜質譜與核磁共振聯(lián)用技術(LC-MS-NMR)發(fā)現(xiàn)牡丹不同根部位的代謝物組成具有明顯差異，對牡丹主根、一級側根和二級側根甲醇提取物的1H-NMR譜圖進行比較得出不同根部位的代謝物類型大致相似，但是蔗糖(sucrose)和苯乙酰類成分(acetophenones)等代謝物信號強度具有明顯差異，該研究為牡丹根皮的等級劃分提供了重要的科學依據(jù)。

3 核磁共振碳譜(13C-NMR)

核磁共振碳譜不僅可提供有機物碳核類型、核間關系、碳分布信息外，還能區(qū)分立體異構體的微細結構。并且13C-NMR能夠測定含碳較多的有機物及不含氫的官能團，可反映出氫譜無法反映的結構，如季碳原子結構，羰基等功能基[30]。通過對核磁共振碳譜中有機物主要碳基團化學位移的分析，有機物的碳化學位移主要分為4個部分：烷基碳區(qū)(0～50 ppm)、烷氧基碳區(qū)(50～110 ppm)、芳香碳區(qū)(110～160 ppm)、羰基碳區(qū)(160～220 ppm)[31-32]。

3.1 13C-NMR在木素研究中的應用

20世紀70年代13C-NMR開始用于木素結構研究領域，由于13C-NMR圖譜化學位移變化較大，獲得的光譜吸收峰銳利，可以辨別出結構上的細微差別，因此有利于有機化合物結構的鑒定和圖譜的解析[33]。并且13C-NMR能實現(xiàn)對木素的各官能團的定量計算，可比較木素在預處理過程中的結構變化規(guī)律以及潛在的斷裂機理[34]。張求慧等[35]對杉木和三倍體毛白楊的苯酚液化物進行核磁共振碳譜分析，結果表明2種木材液化后生成物在碳譜中只是在強度上有些差異，化學位移位置變化不大；在毛白楊液化物碳譜中出現(xiàn)的4個化學位移比杉木液化物的譜線強度要大一些，說明毛白楊液化物中的碳原子較多。許鳳等[36]通過13C-NMR圖譜顯示的有機溶劑法獲得的麥草木素上碳原子信號峰與木素碳譜中碳的化學位移、強度及歸屬進行對照，分析得到木素的主要成分為紫丁香基、愈創(chuàng)木基及少量對羥苯基結構單元；酯鍵連接木素與對香豆酸，酯鍵和醚鍵連接木素與阿魏酸?？梢?3C-NMR不僅可以對木素的結構進行分析，還可以測定其內(nèi)部的鍵連方式。異核單量子關系(HSQC)屬于NMR譜圖中的一種，可探究直接相連的碳氫之間的關系。繆正調(diào)等[37]通過13C-1H HSQC譜圖對經(jīng)過不同水熱環(huán)境處理的核桃殼木素樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)水熱處理過程可以使木素和碳水化合物之間的連接鍵斷裂，適當提高溫度能提取較高純度的木素。徐強等[38]通過13C-1H HSQC譜圖發(fā)現(xiàn)在堿木素側鏈區(qū)域甲醛和對羥基肉桂酸或阿魏酸單元側鏈的雙鍵發(fā)生反應形成了羥甲基；在芳香區(qū)域和對羥基苯基的C-3、C-5，愈創(chuàng)木基的C-5上發(fā)生反應形成了羥甲基。通過HSQC譜圖對木素中的結構單元進行辨別以及歸屬，能夠有效探究木素羥甲基化反應過程及改性前后的結構變化。

3.2 13C-NMR在植物化學結構研究中的應用

傳統(tǒng)化學提取方法會對原始樣品進行熱解，導致樣品的結構組成信息的損壞。而13C-NMR可以直接分析植物樣品中的官能團組成，避免了提取過程中所帶來的結構變化問題，其分析結果更接近于真實狀態(tài)。孫慶雷等[39]發(fā)現(xiàn)金銀花提取物13C-NMR圖譜能鑒別出金銀花的特征化學成分，由于金銀花提取物的碳譜圖具有高度的特征性和重現(xiàn)性，可作為其質量鑒定的相對標準圖譜。隨后孫慶雷等[40]發(fā)現(xiàn)黃芩特征提取物的13C-NMR圖譜包含了黃芩提取物中所有物質的碳信號，其特征峰能反映黃芩的特征信號；將黃芩特征提取物的碳譜與其黃酮類主要有效成分碳譜中的特征峰進行比較，即可以了解黃芩的整體面貌，也可以從其局部特征成分進行鑒別和指認。13C-NMR可以直接測量碳骨架，近年來開始用于有機質結構對污染物吸附影響的研究。廖曉勇等[41]利用13C-NMR技術發(fā)現(xiàn)蜈蚣草離體鮮根樣品中的有機質中比例最多的為烷氧基碳，其次為芳香碳和烷基碳，羧基碳比例較低；但是羧基碳含量隨著菲和砷的加入而升高。由于碳譜信號峰重疊機率較小，其圖譜的特征信號更容易辨別和指認，逐漸成為鑒別植物樣品質量及其結構的有力工具。翁瑞旋等[42]為研究云南束花石斛的化學成分，確定其化學結構，采用核磁共振碳譜和氫譜相結合的方法，通過13C-NMR顯示的碳基團化學位移情況和歸屬所有C、H在結構中的位置，從束花石斛中分離并鑒定了8個化合物。賀鵬等[43]從騰沖紅花油菜籽殼80%乙醇浸提物的乙酸乙酯萃取部分中分離得到2個化合物，并根據(jù)質譜和核磁共振碳譜分析，2個化合物分別鑒定為齊墩果酸和3β-О-乙酸齊墩果酸。因此，核磁共振碳譜是植物化學結構研究中比較行之有效的方法。

4 其他核磁共振波譜在植物研究中的應用

近年來15N-NMR也成為研究植物的一種手段，然而15N磁旋比小，天然豐度低(0.37%)，因此靈敏度比13C低50倍左右，使得15N-NMR的應用受到一定限制[44]。但由于14N-NMR的化學位移較接近15N-NMR，且14N的豐度接近100%，故14N的靈敏度較高，能在組氨酸結構的研究中得到應用。張永洪等[45]介紹了14N-NMR技術定量分析氮含量的方法，并應用該技術測定了腐殖酸樣品中硝酸根離子的含量，定量檢測下限可達毫摩爾級(mmol·L-1)。

氧是地殼中含量最多的元素，占到48.06%。17O作為唯一具有核磁共振信號的氧同位素，其化學位移范圍很寬，而且由于是四極核，在NMR圖譜中除了化學位移作用，還可以利用核的四極相互作用和電場梯度靈敏地考察區(qū)分17O原子核周圍化學環(huán)境的變化信息[46]。沸石是最重要的固體氧化物材料，最早用于研究17O核磁共振技術[47]。雖然17O-NMR提供了豐富的結構信息，但是17O的自然豐度很低(0.037%)，因此17O核磁共振研究需要進行昂貴的同位素富集，而且其富集方法還沒有一套合適的方法[48]，故17O在植物科學研究中的應用較少。

5 存在問題及展望

核磁共振技術在植物科學領域取得了一系列令人矚目的成就，逐漸成為學者關注的重點。但仍存在一些問題，有待進一步解決和改進。

1)信號重疊是植物提取物中復雜光譜的一個問題，妨礙了提取物的識別和量化，因此需要更好的信號分辨率。多維核磁共振波譜法的共振信號分別在多個獨立的頻率軸上傳播，從而減少了信號重疊，但多維核磁共振波譜法的局限是采集時間較長。近年來報道了一種稱作Hadamard譜的快速多維譜方法[49]，在相同的分辨率和信噪比的前提下，基于Hadamard的信號采集時間比傳統(tǒng)方法減少約20倍，因此Hadamard譜或許會成為新的研究趨勢。

2)多種檢測技術相結合拓展了NMR在植物研究領域的應用，不僅簡化了樣品前處理過程，而且能夠提高自動化程度，全面準確地發(fā)掘更多信息，例如LC-NMR技術、LC-SPE-NMR和LC-MS-NMR技術等，但NMR常規(guī)的室溫探頭檢測靈敏度只有毫克級，而色譜、質譜達到了微克級，限制了聯(lián)用技術的廣泛應用。針對這一問題，使用超低溫微量探頭及提高磁場強度可較好的解決這一缺陷[50]，探頭類型相同的情況下，600 MHz比200 MHz譜儀的31P、1H、13C 3種核的檢測靈敏度提高約3～7倍，同時，使用超低溫微量探頭比同頻率的常溫探頭的檢測靈敏度高3～5倍。

3)數(shù)據(jù)庫的建立對于植物研究中數(shù)據(jù)的可持續(xù)使用和挖掘至關重要。與其他平臺相比，NMR生成的數(shù)據(jù)在其重現(xiàn)性方面更加可靠。每當測量出一個植物的NMR圖譜數(shù)據(jù)時，就可以加入數(shù)據(jù)庫，與之前獲得的相同植物的數(shù)據(jù)用于進一步的數(shù)據(jù)挖掘，但前提需要相同的萃取過程，定義和標準化樣品分析的所有步驟，以避免化合物的共振變化。

4)由于核磁共振儀器成本和維護費用較高，一定程度上限制了該技術在植物科學上的應用。今后我們需要提高核磁共振儀器性能，加強技術人員的培訓，以降低儀器成本，并且爭取實現(xiàn)儀器共享，必將促進核磁共振技術在植物研究方面的進一步提高。

5)核磁共振作為一種植物結構分析的常用技術，已應用到植物生理發(fā)育和結構鑒定等方面，目前逐漸深入運用NMR開展不同植物生理生態(tài)學結構與功能方面從宏觀到微觀層次的研究。有關NMR在植物活細胞的生物功能、基因功能和代謝作用，植物根系對養(yǎng)分及鹽分脅迫信號感受轉導與其他信號途徑互作關系的研究也亟待深入。