生物丁醇發(fā)酵研究進(jìn)展

高越 郭曉鵬 楊陽(yáng) 張苗苗，4 李文建 陸棟

（1. 中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所，蘭州 730000；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 蘭州理工大學(xué)，蘭州 730050；4. 甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

生物質(zhì)作為光合作用合成的有機(jī)體的統(tǒng)稱，它包括動(dòng)、植物及微生物，生物質(zhì)的能量來(lái)源于太陽(yáng)，以生物質(zhì)為載體的生物質(zhì)能具有可再生、易降解和低污染等特點(diǎn)［1］。生物燃料作為目前研究最熱且最廣泛的新能源之一，以生物質(zhì)作為載體，產(chǎn)生固、液、氣等綠色可持續(xù)發(fā)展的能源［2］，與生物乙醇相比，丁醇具有能量密度大、燃燒值高、蒸汽壓較低、與汽油配伍性好，能以任意比例和汽油混合［3-4］等多種優(yōu)良生物特性，這使得丁醇現(xiàn)已成為僅次于燃料乙醇的新一代可再生能源，目前通過(guò)生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇已逐漸成為全球研究熱點(diǎn)。但是生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇存在原料成本高、發(fā)酵菌種產(chǎn)能低、發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)物抑制、ABE發(fā)酵產(chǎn)量偏低等問(wèn)題，限制了其規(guī)模化生產(chǎn)及商業(yè)應(yīng)用［5-9］?；谝陨蠁?wèn)題及研究現(xiàn)狀，本文從生物丁醇的可再生原料，代謝調(diào)控和代謝工程角度，評(píng)述了生物丁醇發(fā)酵研究的最新進(jìn)展，旨為工程菌的構(gòu)建和基于過(guò)程工程技術(shù)的代謝調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 生物丁醇發(fā)酵原料研究

1861年P(guān)asteur最早采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，1914年Weizmann發(fā)現(xiàn)梭狀芽孢桿菌（Clostridium acetobutylicum）通過(guò)ABE途徑生產(chǎn)丁醇［10］，該菌可利用葡萄糖、木糖、蔗糖及主要降解產(chǎn)物為糖類的原料生產(chǎn)丁醇。

1.1 常用碳源

傳統(tǒng)工業(yè)上，蔗糖是用于ABE發(fā)酵的碳源之一。拜氏梭菌和丙酮丁醇梭菌以蔗糖為原料，通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸磷酸轉(zhuǎn)移酶途徑發(fā)酵生產(chǎn)丁醇［11］，其中蔗糖酶II復(fù)合物、蔗糖-6-磷酸水解酶和果糖激酶對(duì)蔗糖吸收起正調(diào)控作用。除了單一碳源發(fā)酵，混合糖發(fā)酵過(guò)程中，所有的糖都會(huì)被生產(chǎn)菌種所利用，但利用順序及速率有差異性。有研究發(fā)現(xiàn)，拜氏梭菌BA101糖利用的順序依次是葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及甘露糖［12］。盡管梭菌能利用纖維素二塘、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖，但是葡萄糖仍是其首選的碳源。郭亭等［13］研究了以葡萄糖、木糖、蔗糖和混合糖等為碳源的P2培養(yǎng)基中丁醇的生產(chǎn)情況發(fā)現(xiàn)，不同碳源對(duì)丁醇產(chǎn)率有顯著的影響，葡萄糖和蔗糖為底物時(shí)，丁醇產(chǎn)量可達(dá)12-13 g/L；木糖、混合糖為底物時(shí)，丁醇產(chǎn)量在10 g/L左右。

1.2 淀粉和糖蜜

Virunanon等［14］使用木薯漿和木薯淀粉廢水進(jìn)行丁醇發(fā)酵，該淀粉廢水經(jīng)酶解2 h后作為發(fā)酵碳源，單獨(dú)使用木薯漿時(shí)，丁醇產(chǎn)率極低，只有0.03 g/L，而得到的乙醇則高達(dá)8.98 g/L；單獨(dú)使用木薯淀粉時(shí)，乙醇、丁醇和丙酮產(chǎn)物量分別為1.76、0.85和0.25 g/L，而木薯漿和木薯淀粉混合發(fā)酵則能產(chǎn)生丁醇、乙醇、丙酮分別為2.51，1.76和0.6 g/L，此中調(diào)控丁醇代謝途徑的關(guān)鍵酶還有待進(jìn)一步研究。糖蜜作為一種由水、總糖（蔗糖、葡萄糖和果糖）、重金屬、懸浮膠體、維生素和含氮化合物組成的工業(yè)深色糖漿副產(chǎn)品，它也是用于商業(yè)生產(chǎn)丁醇的原料之一［15］。除此之外，甜菜、甘蔗也是工業(yè)生產(chǎn)的第一批碳源，淀粉原料因其營(yíng)養(yǎng)豐富、價(jià)格低廉、容易獲取，發(fā)酵過(guò)程中不需要添加其他誘導(dǎo)物等特點(diǎn)，是工業(yè)發(fā)酵丁醇的首選原料［16］。但是目前利用這些原料生產(chǎn)丁醇的效率仍然偏低，因此，加大對(duì)此類原料的預(yù)處理和優(yōu)化發(fā)酵條件的研究迫在眉睫。

1.3 甘油和藻類

甘油作為生物柴油生產(chǎn)中的副產(chǎn)品，也可作為碳源被梭菌利用生產(chǎn)丁醇［17］。以甘油為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵的第一個(gè)溶劑生產(chǎn)菌是巴氏梭菌，甘油通過(guò)磷酸化和氧化兩種途徑，部分轉(zhuǎn)化為可用于糖酵解途徑的二羥基丙酮磷酸鹽（Dihydroxyacetone phosphate，DHAP）［11］。與其他原料相比，藻類以其增長(zhǎng)率高，水需求量少，高效二氧化碳減排等優(yōu)勢(shì)，可作為一種ABE生產(chǎn)的環(huán)保型潛在原料。但藻類的生物量是在一種極稀的溶液中產(chǎn)生的，此溶液在分離和下游加工時(shí)的成本相對(duì)較高，這是利用藻類生產(chǎn)丁醇亟待解決的問(wèn)題之一［18］。

1.4 甜高粱

甜高粱作為粒用高粱的一個(gè)變種，它的秸稈含糖量較高，出汁率可達(dá)60%，其中以蔗糖、葡萄糖、果糖為主，還含有少量其他可溶性糖，是良好的發(fā)酵用原料。程意峰等［19］以甜高粱秸稈汁為發(fā)酵原料，挑選可以利用甜高粱汁高效生產(chǎn)丁醇的菌種作為試驗(yàn)菌株，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件優(yōu)化，使丁醇產(chǎn)量從原來(lái)的4.415 g/L為提高到10.29 g/L，甜高粱汁無(wú)需水解，滅菌冷卻后可直接接種發(fā)酵，是工業(yè)化生產(chǎn)丁醇的優(yōu)質(zhì)原料。

1.5 木質(zhì)纖維素

發(fā)酵原料的可用性和經(jīng)濟(jì)可行性，是當(dāng)前生物丁醇研究的挑戰(zhàn)。高效利用低成本木質(zhì)纖維素廢料作為ABE發(fā)酵的碳源，不僅是實(shí)現(xiàn)生物丁醇經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)的優(yōu)良方法，而且可從根本上解決溫室氣體排放，緩解全球能源危機(jī)［7］。

麥麩、玉米秸稈和木質(zhì)生物材料為目前常用的纖維素原料。Liu等［20］利用麥麩-稀酸水解液作為ABE發(fā)酵的原料，使用拜氏梭菌ATCC 55025，經(jīng)72 h發(fā)酵后，總?cè)軇┊a(chǎn)量為11.8 g/L，其中丁醇量為8.8 g/L，此研究表明麥麩可作為ABE發(fā)酵的潛在可再生資源。針對(duì)一些可溶性木素對(duì)發(fā)酵過(guò)程的抑制問(wèn)題，Liu等［21-22］開展了玉米秸稈水解液對(duì)產(chǎn)丁醇梭菌影響的深入研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈水解液可以抑制梭菌生長(zhǎng)及其對(duì)糖的利用，顯著改變發(fā)酵產(chǎn)物比例，研究表明這種抑制作用可以在一定程度上通過(guò)氫氧化鈣堿預(yù)處理去除，Zhang等［23］利用Ca（OH）2預(yù)處理玉米秸稈，再經(jīng)纖維素酶法水解，可去除木質(zhì)纖維素酶解抑制劑，是提高木質(zhì)纖維素酶消化率的一種有效方法，同時(shí)玉米秸稈也被證實(shí)是生產(chǎn)丁醇的良好的原料。纖維素是化學(xué)紙漿生產(chǎn)的主要原料，而木質(zhì)素、半纖維素和外酯3種成分可以被認(rèn)為是紙漿工業(yè)的副產(chǎn)品，原料在燃燒過(guò)程中，半纖維素是許多工廠未充分利用的可再生資源，所以提取黑液中的半纖維素，并將其用于生物化學(xué)轉(zhuǎn)化為燃料和化學(xué)品是一個(gè)充滿吸引力的商業(yè)發(fā)展方向。Kudahettige-Nilsson等［24］以二氧化碳酸化法回收硬木牛皮紙黑液中的酸水解木聚糖為唯一碳源，采用活性炭對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行解毒，研究ABE發(fā)酵,論證了利用工業(yè)牛皮紙制漿黑液作為原料生產(chǎn)生物燃料（如丁醇）的可行性。。

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是地球上生物燃料生產(chǎn)中最豐富的可再生資源，作為一種非食品廉價(jià)原料，使得利用纖維素原料進(jìn)行丁醇發(fā)酵成為可能，且具有很大的潛力［25］。但是，針對(duì)某些原料木質(zhì)素含量高、預(yù)處理復(fù)雜、酶解糖化成本高以及戊糖發(fā)酵轉(zhuǎn)化效率低等問(wèn)題，仍需要做近一步探究，以解決相關(guān)關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。

2 過(guò)程工程代謝調(diào)控

利用外源添加的宏觀調(diào)控策略，簡(jiǎn)單有效的改變體系組成與濃度水平，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞水平上的生理代謝活動(dòng)，如胞內(nèi)碳流代謝、氧化還原平衡及NAD（P）H水平、細(xì)胞毒性脅迫效應(yīng)，以及應(yīng)激蛋白和關(guān)鍵酶表達(dá)水平等。

2.1 碳流代謝

早期研究發(fā)現(xiàn)外源添加乙酸或丁酸，能夠抑制丙酮丁醇梭菌產(chǎn)酸代謝，誘導(dǎo)丙酮丁醇代謝［26-27］。Hüsemann等［28］向培養(yǎng)基中添加30 mmol/L乙酸，發(fā)現(xiàn)丙酮丁醇梭菌產(chǎn)溶劑階段并未提前，但發(fā)酵終點(diǎn)的丁醇產(chǎn)量提高至37 mmol/L。Cho等［29］針對(duì)丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌對(duì)不同濃度乙酸外源添加條件下發(fā)酵性能的比較，研究結(jié)果顯示，丙酮丁醇梭菌在3.7-9.7 g/L乙酸濃度下，隨濃度升高ABE發(fā)酵能力呈上升趨勢(shì)，當(dāng)乙酸濃度超過(guò)11.7 g/L，其溶劑代謝則受到抑制作用；相反，拜氏梭菌對(duì)于不同乙酸添加條件，其溶劑生產(chǎn)水平無(wú)明顯變化。

添加芐基紫精、甲基紫精及甲基藍(lán)等人工電子載體的外源調(diào)控策略，能夠抑制產(chǎn)氫代謝，增加還原力NAD（P）H水平，有利于溶劑生產(chǎn)代謝［30］。早在1986年，Jones等［31］研究了芐基紫精在丙酮丁醇梭菌連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中的調(diào)控作用發(fā)現(xiàn)，其能夠改變碳流代謝方向，使發(fā)酵過(guò)程迅速進(jìn)入產(chǎn)溶劑階段。此外，關(guān)于甲基紫精提高依賴NADH的醇醛脫氫酶活性以及提高溶劑產(chǎn)量的研究數(shù)量也在逐漸增加。

2.2 氧化還原水平及毒性脅迫效應(yīng)

Ujor等［30］分別在2014年和2015年研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中外源添加甘油和別嘌呤醇能夠在高濃度糠醛脅迫條件下，促進(jìn)菌體生產(chǎn)以及糠醛脫毒效率，同時(shí)提高溶劑代謝。但是二者的區(qū)別在于，甘油的存在可顯著提高NADH水平，利于溶劑生成，同時(shí)NAD（P）H可以將有高毒性的糠醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為低毒性，降低毒性脅迫；而別嘌呤則是通過(guò)調(diào)控機(jī)制降低糠醛對(duì)DNA的損傷，來(lái)緩解毒性脅迫對(duì)菌體產(chǎn)溶劑期轉(zhuǎn)變?cè)斐傻牟涣加绊懀?2-34］。Sabra等［35］研究了外源添加甘油對(duì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的影響，發(fā)現(xiàn)甘油增強(qiáng)溶劑丁醇產(chǎn)量2.6倍，這為木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵生產(chǎn)丁醇所遇到的毒性抑制物制約因素提供了研究方向。有研究表明，木質(zhì)纖維素原料經(jīng)降解生成的呋喃類化合物糠醛在0.5-2.0 g/L濃度范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)ABE發(fā)酵有正向調(diào)控作用，相反，當(dāng)糠醛濃度超過(guò)2.0 g/L，則會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制作用［36］。

2.3 應(yīng)激蛋白及關(guān)鍵酶表達(dá)

Han等［37］研究了鈣離子對(duì)丁醇發(fā)酵的調(diào)控作用，在拜氏梭菌NCIMB8052發(fā)酵培養(yǎng)基中外源添加0.5 g/L碳酸鈣或氯化鈣，可分別提高ABE發(fā)酵產(chǎn)量至15 g/L或17 g/L，Han研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì)該菌進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在碳酸鈣調(diào)控作用下，拜氏梭菌NCIMB8052胞內(nèi)與碳源轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝關(guān)鍵酶以及其他關(guān)鍵功能蛋白表達(dá)水平有顯著提高，與原核細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

此外，鎂離子、錳離子和鋅離子，二價(jià)鐵離子在調(diào)控代謝關(guān)鍵酶活性方面也有重要的作用。乙酸代謝途徑過(guò)程中，鎂離子和錳離子具有調(diào)控乙酸激酶催化活性的功能［38-39］，而二價(jià)鐵離子和鋅離子則是分別作為丙酮丁醇梭菌氫化酶和丁醇脫氫酶的關(guān)鍵輔因子，對(duì)ABE 發(fā)酵進(jìn)行潛在調(diào)控［40-41］。Wu等［42］研究了ABE發(fā)酵過(guò)程中，鋅離子的添加對(duì)于有機(jī)酸等毒性代謝物耐受性的影響發(fā)現(xiàn)，在0.45 g/L甲酸存在下，相比對(duì)照組利用29.49 g/L葡萄糖產(chǎn)生5.27 g/L丁醇，有鋅離子添加的實(shí)驗(yàn)組利用55.24 g/L葡萄糖產(chǎn)生11.28 g/L丁醇。更重要的是，鋅離子的存在對(duì)于菌體耐受毒性代謝物有顯著影響。

3 產(chǎn)丁醇梭菌遺傳改造與代謝工程

對(duì)于低生產(chǎn)率、丁醇產(chǎn)物抑制等ABE發(fā)酵產(chǎn)物障礙仍需通過(guò)微生物育種的方式解決。微生物選育的手段有很多，包括定向育種、誘變育種、雜交育種、細(xì)胞融合和基因工程等育種技術(shù)，其目的就是要把生物合成代謝途徑朝著目的方向引導(dǎo)，或者促使細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生重新組合，從而優(yōu)化遺傳性狀，定向地使某些代謝產(chǎn)物過(guò)量積累，獲得所需要的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和低耗的菌種。

在目前的條件下，昂貴的發(fā)酵底物，大量合成的副產(chǎn)品，以及產(chǎn)物正丁醇濃度較低（＜15 g/L）等因素使傳統(tǒng)丙酮丁醇梭菌的工業(yè)化發(fā)酵可行性不高。研究者們已經(jīng)嘗試通過(guò)微生物代謝工程去提高梭狀芽孢桿菌產(chǎn)溶劑性能或是構(gòu)建正丁醇生產(chǎn)菌株。利用基因工程手段修飾或者改造丁醇生產(chǎn)菌的一些代謝途徑，達(dá)到提高丁醇產(chǎn)率，解除產(chǎn)物阻遏效應(yīng)等目的。穿梭載體、轉(zhuǎn)化和接合、轉(zhuǎn)座誘變、報(bào)告基因、RNA干擾技術(shù)和DNA基因芯片等遺傳工具及技術(shù)對(duì)于梭菌屬代謝工程的成功至關(guān)重要，丙酮丁醇梭菌 ATCC 824菌株及其突變體作為良好的基因改良對(duì)象，關(guān)于基因和代謝工程技術(shù)的內(nèi)源改造已有較多應(yīng)用研究［43］。

Spo0A是控制產(chǎn)孢的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，它也同時(shí)調(diào)控丙酮、丁醇的產(chǎn)生，它對(duì)溶劑形成的影響是調(diào)節(jié)芽孢與溶劑基因表達(dá)的平衡作用：它的過(guò)度表達(dá)打破了孢子生成與溶劑產(chǎn)生的平衡關(guān)系，研究表明Spo0A 過(guò)表達(dá)菌株824（pMSPOA）的丁醇產(chǎn)量更高［44］。Dürre［45］在研究中也提出了其他的調(diào)控因子。AdcR和AdcS是新的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控因子［46］，CodY和CcpA是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中的多效調(diào)控蛋白［47］。丙酮丁醇梭菌 ATCC824的最佳基因修飾之一是表達(dá)醇/醛脫氫酶基因aad（也稱adhE1）的solR 敲除突變體［48］。Harris等［49］研究結(jié)果表明，solR在調(diào)節(jié)溶劑形成過(guò)程中起著重要的作用。通過(guò)發(fā)酵表征和代謝通量分析發(fā)現(xiàn)，solR失活丙酮丁醇梭菌菌株（SolRH）具有較高的葡萄糖利用率，與野生型相比，該菌株產(chǎn)生較高濃度的溶劑；SolRH（pTAAD）菌株在失活solR的基礎(chǔ)上帶有一個(gè)含用于丁醇生產(chǎn)的aad拷貝基因的編碼質(zhì)粒，這使得其丁醇產(chǎn)率達(dá)到17.6 g/L。采用基因失活和基因過(guò)表達(dá)兩種代謝工程方法，是研究某些特殊基因修飾對(duì)梭狀芽胞桿菌發(fā)酵特性影響的有效方式。在敲除丁酸激酶基因（buk）菌株的發(fā)酵液中，丁醇的產(chǎn)量可達(dá)16.7 g/L［50］。代謝工程菌增加丁醇產(chǎn)量的直接策略通常是使得除丁醇外生產(chǎn)其他溶劑的的基因失活。Kuit等［51］通過(guò)中斷丙酮丁醇梭菌內(nèi)的乙酸激酶基因（ack），導(dǎo)致其乙酸生產(chǎn)量降低80%，而丁醇、乙醇等其他溶劑產(chǎn)量均有所增加（16%）。參與蔗糖分解代謝的3個(gè)重要基因（scrA、scrB和scrK），以及一個(gè)醛/醇脫氫酶基因（adhE1），Zhang等［52］從丙酮丁醇梭菌菌體中克隆相關(guān)基因并引入到已敲除乙酸激酶基因（ack）的酪丁酸梭菌中，在進(jìn)行重組菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，本來(lái)不能利用蔗糖的酪丁酸梭菌可利用甘蔗汁產(chǎn)生14.8-18.8 g/L丁醇。

梭菌的靶向基因敲除工具主要是通過(guò)ClosTron方法實(shí)現(xiàn)。該法主要是由Heap等［53］首創(chuàng)并改進(jìn)得到的一種可靠的針對(duì)梭菌屬基因敲除技術(shù)，ClosTron質(zhì)?？商峁┧{(lán)白篩選和其他鑒定重組質(zhì)粒的選擇方法，改進(jìn)后的ClosTron系統(tǒng)取代了原型質(zhì)粒pMTL007和原始方法，更充分地利用了II類內(nèi)含子的潛力。2012年，Heap團(tuán)隊(duì)公開發(fā)表了一種基于等位基因交叉互換將大DNA片段整合到梭菌染色體上的新方法，此項(xiàng)研究為DNA的可靠整合開辟了新道路，包括多種微生物的大型合成結(jié)構(gòu)［54］。刪除策略和誘導(dǎo)啟動(dòng)子系統(tǒng)也是在不斷開發(fā)的技術(shù)［45］。通過(guò)代謝工程改造丁酸梭菌25755，讓其超表達(dá)醛/醇脫氫酶2（adhE2）在原生硫代酶啟動(dòng)子（thl）控制下，將丁酰基輔酶A轉(zhuǎn)化為丁醇［55］。為滿足工業(yè)生產(chǎn)生物燃料乙醇/異丙醇/丁醇組成的混合物，有研究建立不同的合成異丙醇操縱子通過(guò)穿梭質(zhì)粒引入丙酮丁醇梭菌ATCC824，構(gòu)建代謝工程菌進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)［56］。Bankar 等［57］利用基因手段研究開發(fā)出一種DSM 792型菌株，通過(guò)使用等位基因-偶聯(lián)交換，將拜式梭菌NRRLB593 的第二乙醇脫氫酶引入丙酮丁醇梭菌內(nèi)，從而達(dá)到丙酮轉(zhuǎn)化為異丙醇的目的，提高異丙醇的產(chǎn)量。

此外，還有一些經(jīng)典實(shí)例，如在不影響溶劑的情況下，阻斷孢子形成過(guò)程［58］，通過(guò)單一點(diǎn)突變的方式，增加菌體耐氧性［59］。為了增加丙酮丁醇梭菌對(duì)丁醇耐受性，Tomas等［60］通過(guò)在菌體中過(guò)量表達(dá)分子伴侶GroESL蛋白，增強(qiáng)了重組菌對(duì)丁醇的耐受性，同時(shí)丁醇的產(chǎn)量也提高到17 g/L。

目前對(duì)于產(chǎn)丁醇工程菌構(gòu)建的研究主要集中在利用關(guān)鍵基因過(guò)表達(dá)和基因敲除技術(shù)對(duì)丙酮丁醇梭菌進(jìn)行遺傳改造。但是，考慮到梭菌的分子技術(shù)操作復(fù)雜，難度較大，且目前所得重組菌并未達(dá)到工業(yè)要求產(chǎn)量，因此，遺傳改造技術(shù)及菌體內(nèi)部分子機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

4 展望

近年來(lái)，生物丁醇作為一種生物燃料，針對(duì)能源、環(huán)境、經(jīng)濟(jì)發(fā)展的現(xiàn)實(shí)要求，它的生產(chǎn)及研究開發(fā)已經(jīng)引起了越來(lái)越多的關(guān)注。生物丁醇的多項(xiàng)性能優(yōu)于第一代生物燃料，前景廣闊，雖然發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇在環(huán)保和節(jié)約能源方面有許多優(yōu)勢(shì)，但它同時(shí)也存在一些問(wèn)題，制約著它的發(fā)展。為滿足大批量工業(yè)化生產(chǎn)，根據(jù)近年生物丁醇研究的國(guó)內(nèi)外進(jìn)展情況和存在的問(wèn)題，可以從以下幾個(gè)方面加強(qiáng)研究。（1）嘗試?yán)昧畠r(jià)原料，以甜高粱、木質(zhì)纖維素等廉價(jià)非糧食作物為原料，利用低成本發(fā)酵原料在最大程度上提高產(chǎn)物丁醇的產(chǎn)率，實(shí)現(xiàn)廉價(jià)生物材料工業(yè)轉(zhuǎn)化的同時(shí)，經(jīng)濟(jì)環(huán)保生產(chǎn)生物丁醇從根本上解決溫室氣體排放，緩解全球能源危機(jī)。（2）通過(guò)研究丁醇合成代謝途徑，得知或預(yù)知產(chǎn)物生物合成過(guò)程，以宏觀代謝調(diào)控的方式增加限速步驟的代謝通量，然后改變培養(yǎng)環(huán)境增加流向產(chǎn)物合成的代謝流，從而使產(chǎn)物的產(chǎn)率大幅度提高，同時(shí)減少分叉代謝途徑的代謝通量即可以提高目標(biāo)代謝途徑的碳流量。（3）隨著分子生物學(xué)以及相關(guān)技術(shù)手段的不斷發(fā)展，利用基因工程手段對(duì)微生物進(jìn)行遺傳改造，定向地改變或優(yōu)化生物體遺傳性狀，為工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良高產(chǎn)菌種。對(duì)產(chǎn)丁醇生產(chǎn)菌而言，提高菌種的丁醇耐受性以及強(qiáng)化與丁醇合成緊密相關(guān)的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，以期提高菌種的丁醇耐受性及產(chǎn)量是主要研究目標(biāo)。