中華鱘外周血細(xì)胞組成及形態(tài)觀察

張艷珍　王彥鵬　危起偉　杜　浩　劉志剛　胡維勇　張曉雁

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所, 武漢 430223; 2. 北京信沃達(dá)海洋科技有限公司(北京海洋館), 北京 100081)

血細(xì)胞在動物的生命活動中起著重要作用, 是動物體對自身生理狀態(tài)變化和對外界環(huán)境因子刺激非常敏感的細(xì)胞, 是機(jī)體免疫的重要成分, 具有吞噬、分泌等多種功能, 參與機(jī)體的傷口修復(fù)和防御等生理機(jī)制。魚類的血細(xì)胞的功能與維持體內(nèi)各種生理環(huán)境的穩(wěn)定性有密切關(guān)系, 形態(tài)與數(shù)量變化是魚類健康判斷、疾病診斷與預(yù)防的重要依據(jù),已有多種魚類進(jìn)行相關(guān)研究[1,2]。鱘魚相關(guān)研究也較多, 包括大西洋鱘(Acipenser oxyrinchus)、短吻鱘(Acipenser brevirostrum)、歐洲鰉(Huso huso)、納氏鱘(Acipenser naccarii)、高首鱘(Acipenser transmontanus)、史氏鱘(Acipenser schrenckii)等[3—8]。中華鱘(Acipenser sinensis)作為國家一級保護(hù)動物,目前處于極危狀態(tài)[9], 但對于中華鱘血細(xì)胞形態(tài)研究僅見1齡幼魚報(bào)道[10]。北京海洋館作為中華鱘重要的遷地保護(hù)和保育科教基地之一, 育有多尾野生中華鱘和各齡子一代及子二代中華鱘, 養(yǎng)殖中采用單尾護(hù)理的方式[11—12], 利于對個(gè)體研究與評價(jià)。本次通過對從幼體到成體多個(gè)年齡中華鱘血細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察, 了解中華鱘血細(xì)胞的組成與功能, 旨在為中華鱘的健康保育研究提供基礎(chǔ)依據(jù), 同時(shí)為動物血細(xì)胞研究相關(guān)領(lǐng)域豐富基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1　研究對象

40尾中華鱘來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所中華鱘養(yǎng)殖基地, 在北京海洋館長期馴養(yǎng),包括野生中華鱘2個(gè)年齡組, 人工繁殖子一代中華鱘4組, 子二代1組, 信息如表 1所示。

1.2　養(yǎng)殖條件

養(yǎng)殖池體規(guī)格29.0 m (長)×11.0 m (寬) ×4.4 m(高), 配置20.0 m ×3.0 m的展示觀察窗, 兩側(cè)設(shè)置從展窗面向?qū)γ娉乇诘乃剿? 與展窗呈近45°角向池體后方水流。養(yǎng)殖水溫21.0—22.5 ℃, 溶氧7.0—7.8 mg/L, pH 7.5—8.0, 濁度＜ 0.07 NTU。池體上方設(shè)置7盞1000 W金屬鹵素?zé)粽彰? 光周期設(shè)定為10h∶14h (光∶暗), 從池體底部到水體表面的白天照度多介于50—4000 lx, 夜間為全黑。養(yǎng)殖密度小于2.4 kg/m3。餌料種類包括生鮮餌料和特制混合餌料, 投喂率約1%, 每周3次, 采用水下單獨(dú)投喂方式。

1.3　光鏡和電鏡樣本制備

血液采集： 實(shí)驗(yàn)中華鱘停食3d后進(jìn)行血液采集, 尾靜脈采血注入肝素鋰抗凝管中備用, 采血后立即血涂片, 每個(gè)樣本制備5個(gè)血涂片, 檢測在采血后2h內(nèi)開始。

光鏡樣本： 新鮮血液制備涂片, 自然干燥, 采用Wright-Giemsa法進(jìn)行染色, 自來水沖洗自然干燥后在Olympus CX41油鏡下觀察。

電鏡樣本： 血液經(jīng)10000 r/min低溫離心10min后, 使用一次性毛細(xì)針筒吸取白細(xì)胞層和少量紅細(xì)胞, 采用2.5%戊二醛固定后, 常規(guī)透射電鏡生物樣品制備方法制備電鏡樣品, 在FEI TECNAI G220型透射電鏡及成像系統(tǒng)下觀察并采集圖片。

1.4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

細(xì)胞測量方法： 圓形、橢圓或較規(guī)則細(xì)胞直接測量最長和最短直徑; 不規(guī)則細(xì)胞測量最長徑和與其垂直方向的直徑分別作為長短徑;

表 1　中華鱘樣本信息Tab. 1　Information of the animal

細(xì)胞核測量方法： 圓形、近圓形、腎形、桿狀或較規(guī)則核型直接測量最長和最短直徑; 分葉核型細(xì)胞的長短徑分別測量各葉的長徑和短徑。

使用LQ530顯微數(shù)碼成像裝置及圖像處理系統(tǒng)采集圖片, 進(jìn)行各類細(xì)胞及細(xì)胞核長短徑測定,單位 μm。其中紅細(xì)胞每個(gè)樣本測量20個(gè)細(xì)胞, 其他類型細(xì)胞每個(gè)樣本測量5—10個(gè)細(xì)胞, 結(jié)果取各類型所有細(xì)胞的平均值, 以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。采用SPSS分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2　結(jié)果

2.1　血細(xì)胞組成與大小

中華鱘外周血可見細(xì)胞中最多的是紅細(xì)胞(Erythrocyte), 紅細(xì)胞平均密度為(5.56 ± 1.19) ×108/mL, 白細(xì)胞(Leukocyte)和血栓細(xì)胞(Thrombocyte)占少數(shù), 平均密度分別為(16.53 ± 4.94)×106/mL和(15.53 ± 15.82)×106/mL, 血栓細(xì)胞數(shù)量波動大。其中白細(xì)胞中數(shù)量最多的是淋巴細(xì)胞(Lymphocyte)約占83%, 大淋巴和小淋巴各自比例詳見表 2, 其次是嗜中性粒細(xì)胞(Neutrophil)、單核細(xì)胞(Monocyte),最少的是嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophil), 各自比例詳見表 2。未見到嗜堿性粒細(xì)胞(Basophil)。

對不同年齡中華鱘的血細(xì)胞密度及組成進(jìn)行比較(表 2), 結(jié)果顯示： RBC值為18齡和11齡較低,與其他齡組之間存在顯著性差異(P＜0.05), ＞30齡(W-N)組略高于其他組, 差異不顯著; WBC值為18齡、4齡分別與其他齡組間存在顯著性差異(P＜0.05), DLC結(jié)果中NEU和LYM比例顯示18齡、4齡分別與其他齡組間存在顯著性差異(P＜0.05), 子一代各齡之間有差異不顯著, 另2類白細(xì)胞之間年齡間變化大。

細(xì)胞的測量結(jié)果均值詳見表 3。在本次試驗(yàn)中單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞個(gè)體最大, 細(xì)胞大小范圍分別為(14.95—21.93) μm ×(8.89—18.79) μm和(9.45—22.69) μm ×(9.18—17.85) μm; 其次是嗜酸性粒細(xì)胞和大淋巴細(xì)胞, 細(xì)胞大小范圍分別為(14.20—17.09) μm ×(13.42—16.39) μm和(12.95—24.39) μm×(6.30—18.19) μm, 酸性粒細(xì)胞的直徑差異極小; 依次為紅細(xì)胞(13.00—18.54) μm ×(7.94—13.25) μm,血栓細(xì)胞和小淋巴細(xì)胞最小, 細(xì)胞大小范圍分別為(9.71—15.62) μm ×(4.54—11.61) μm和(7.51—12.84) μm ×(5.91—10.89) μm。各類血細(xì)胞結(jié)構(gòu)和大小在不同年齡組間無顯著差異, 僅個(gè)別魚體略有區(qū)別。

表 2　不同年齡血細(xì)胞組成比較Tab. 2　The blood cell types of different ages

表 3　血細(xì)胞組成及細(xì)胞大小Tab. 3　The blood cell types and the sizes of different cells

2.2　光鏡觀察結(jié)果

通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 中華鱘外周血涂片中紅細(xì)胞的數(shù)量最多, 白細(xì)胞和血栓細(xì)胞數(shù)量較少,單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)聚集分散在紅細(xì)胞之間。白細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。

紅細(xì)胞紅細(xì)胞呈橢圓或卵圓形, 表面光滑,細(xì)胞核形狀與細(xì)胞形狀相似, 位于細(xì)胞中央, 少數(shù)略偏位, 細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)多質(zhì)密, 被染色為深紫藍(lán)色, 無核仁。細(xì)胞質(zhì)豐富, 細(xì)胞質(zhì)被染色為灰藍(lán)色(圖版Ⅰ-1—17)。部分血涂片染色過程中環(huán)境偏堿性, 細(xì)胞呈灰藍(lán)色。另偶可見圓形原紅細(xì)胞。

淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形, 大小不等, 可分為大淋巴和小淋巴細(xì)胞(圖版Ⅰ-1—4), 細(xì)胞核質(zhì)比大, 是白細(xì)胞中數(shù)量最多的類型。細(xì)胞核多為圓形或腎形, 染色質(zhì)致密呈塊狀,無核仁, 著色深紫紅色。細(xì)胞質(zhì)較少, 染色為藍(lán)色,多數(shù)有明顯的偽足突起, 有的呈一薄層包裹細(xì)胞核,有的經(jīng)胞吞呈空泡狀似漿細(xì)胞(Plasma cell)(圖版Ⅰ-3), 有的胞質(zhì)幾乎不可見, 細(xì)胞近似裸核。其中大淋巴細(xì)胞少數(shù), 胞核顏色較小淋巴略淺。外周血中偶可見正在分裂的淋巴細(xì)胞(圖版Ⅰ-4)。未見到原淋巴細(xì)胞和幼淋巴細(xì)胞。

嗜中性粒細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形等, 細(xì)胞較大, 核質(zhì)比低于淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞(圖版Ⅰ-5—7)。細(xì)胞核為彎曲呈腎形、桿狀(圖版Ⅰ-5)、帶狀或分葉型(圖版Ⅰ-6、7),桿狀和分葉核型數(shù)量多, 分葉核一般2—5葉, 核常偏于細(xì)胞一側(cè), 細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)較質(zhì)密, 被染色為紫紅色或藍(lán)紫色, 無核仁。細(xì)胞質(zhì)豐富, 被染色較淺, 呈淡粉紅色, 少數(shù)無色, 布滿少量細(xì)小、淡紫色或紅色小顆粒, 大小不均勻。未見到原粒細(xì)胞、早幼和中幼粒細(xì)胞。

嗜酸性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞多呈圓形, 個(gè)別卵圓形, 細(xì)胞中等偏大, 核質(zhì)比小, 數(shù)量極少, 在血涂片中偶爾見到(圖版Ⅰ-8—10)。細(xì)胞核常因胞漿顆粒覆蓋不能見完整形狀, 主要為桿狀或分葉形等, 分葉核多, 常見2—3葉, 核偏于細(xì)胞一側(cè)或貼細(xì)胞膜, 細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)致密, 被染色為藍(lán)紫色, 無核仁。細(xì)胞質(zhì)豐富, 充滿了大小均勻的圓形橘紅色嗜酸性顆粒, 數(shù)量不盡相同, 細(xì)胞表面常可見飽滿顆粒溢出胞膜。未見到嗜酸早幼粒細(xì)胞和中幼粒細(xì)胞。

單核細(xì)胞單核細(xì)胞呈橢圓形、不規(guī)則形或圓形, 細(xì)胞較大, 核質(zhì)比介于中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞之間, 在血涂片中數(shù)量極少(圖版Ⅰ-11—14)。細(xì)胞核形狀多樣, 包括腎形、馬蹄形、分葉或不規(guī)則等, 略偏于細(xì)胞一側(cè), 染色質(zhì)多疏松網(wǎng)狀, 染色呈淡紫紅色或淡紫色, 無核仁。細(xì)胞質(zhì)較豐富, 細(xì)胞質(zhì)被染色為灰藍(lán)色或藍(lán)色, 染色不均勻且可見有些胞漿內(nèi)含有空泡(圖版Ⅰ-12、13)。在顯微鏡下, 單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞有時(shí)難以區(qū)分, 差異詳見表 4。

血栓細(xì)胞血栓細(xì)胞呈長桿形、圓形或橢圓形, 表面大部分光滑, 僅2端常有放射狀延長突出,細(xì)胞較小, 核質(zhì)比變化大, 其數(shù)量接近淋巴細(xì)胞, 在血涂片中多為單個(gè)出現(xiàn), 有時(shí)數(shù)個(gè)聚集在一起成團(tuán)出現(xiàn)(圖版Ⅰ-15—17)。細(xì)胞核呈長桿形、橢圓形或腎形等, 位于細(xì)胞中央, 少數(shù)偏位, 細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)致密, 被染色為紫紅色。細(xì)胞質(zhì)胞漿量隨細(xì)胞的不同形狀差別大, 長桿狀細(xì)胞的胞漿量近2倍于細(xì)胞核, 圓形或橢圓形僅一薄層包裹細(xì)胞核, 細(xì)胞質(zhì)染色較淡, 呈粉紅色。另, 外周血中常見到正在分裂或剛形成的血栓細(xì)胞(圖版Ⅰ-17)。

2.3　電鏡觀察結(jié)果

電鏡下可觀察到細(xì)胞類型有六大類, 包括紅細(xì)胞、血栓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、Ⅰ型粒細(xì)胞、Ⅱ型粒細(xì)胞、單核細(xì)胞。

紅細(xì)胞紅細(xì)胞質(zhì)膜表面大部分較平滑, 個(gè)別部位出現(xiàn)質(zhì)膜內(nèi)褶。細(xì)胞質(zhì)電子密度低, 可見到少量線粒體或個(gè)別部位電子密度略高(圖版Ⅱ-1、2)。核周間隙明顯, 核孔多個(gè)且清晰, 異染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀沿核膜分布和分散在核內(nèi), 未見到核仁。

淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞質(zhì)膜表面常形成細(xì)小的圓形或指狀突起(圖版Ⅱ-3)。細(xì)胞質(zhì)電子密度高于紅細(xì)胞, 環(huán)繞著幾乎占據(jù)整個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核, 胞質(zhì)有豐富的細(xì)胞器包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、溶酶體、游離核糖體以及個(gè)別空泡(圖版Ⅱ-4); 核周間隙不明顯, 核孔清晰, 異染色質(zhì)呈帶狀或塊狀。也有部分淋巴細(xì)胞質(zhì)膜延伸成長突起或形成褶皺, 或胞漿散出, 可見大量胞吞作用。

Ⅰ型(嗜中性)粒細(xì)胞Ⅰ型(嗜中性)粒細(xì)胞質(zhì)膜表面常有細(xì)長或粗大的突起。細(xì)胞質(zhì)含大量分散的特殊小顆粒, 呈長短不一的桿狀或長橢圓形等, 直徑0.2—1 μm不等, 顆粒電子密度高, 由膜包被, 內(nèi)涵物均勻(圖版Ⅱ-9、13、14)。溶酶體電子密度較低, 呈大小不一的圓形, 內(nèi)涵物均勻。細(xì)胞質(zhì)中還有豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及游離核糖體等細(xì)胞器(圖版Ⅱ-10—12)。核膜清晰, 異染色質(zhì)疏松。?？梢姲|(zhì)中有多個(gè)胞吞過程或形成的空泡, 并發(fā)現(xiàn)特殊顆粒的胞吞作用(圖版Ⅱ-10)。

Ⅱ型(嗜酸性)粒細(xì)胞Ⅱ型(嗜酸性)粒細(xì)胞質(zhì)膜表面形成大量細(xì)小的指狀突起或膜包被游離至細(xì)胞外。細(xì)胞質(zhì)含大量的特殊大顆粒, 幾乎覆蓋整個(gè)細(xì)胞, 多數(shù)呈圓形或近圓形, 直徑0.5—2 μm不等, 顆粒電子密度深, 由膜包被, 內(nèi)含物均勻。溶酶體電子密度較低, 明顯小于特殊顆粒, 呈大小不一的圓形, 內(nèi)涵物均勻(圖版Ⅱ-17、18)。細(xì)胞質(zhì)中還有豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體及游離核糖體等細(xì)胞器(圖版Ⅱ-19)。細(xì)胞核小,偏向一側(cè), 核膜核孔清晰, 異染色質(zhì)疏松呈塊狀。

單核細(xì)胞單核細(xì)胞質(zhì)膜表面有指狀或短粗突起, 細(xì)胞多變形。細(xì)胞質(zhì)含大量的溶酶體和顆粒, ?？梢姶罅靠张?圖版Ⅱ-5—8)。溶酶體電子密度不一, 大小不等, 個(gè)別呈空泡狀。核內(nèi)異染色質(zhì)少, 沿核膜分布。少見到顆粒。

血栓細(xì)胞血栓細(xì)胞質(zhì)膜表面一端或兩端常形成長指狀突起。細(xì)胞質(zhì)電子密度較低, 含許多小空泡或幾個(gè)電子密度極高的顆粒, 部分空泡開口于細(xì)胞表面。核膜清晰, 異染色質(zhì)呈帶狀沿核膜分布(圖版Ⅱ-15、16)。

3　討論

3.1　血細(xì)胞的組成與大小

血細(xì)胞的組成受到魚體大小、發(fā)育階段、營養(yǎng)水平、環(huán)境條件、應(yīng)激水平以及采血過程等多種因素影響[13], 本次血液樣本的采集中嚴(yán)格控制操作時(shí)間與過程, 所有樣本在采樣前均已在養(yǎng)殖池體內(nèi)養(yǎng)殖多年, 并經(jīng)過長時(shí)間的親和訓(xùn)練和捕撈訓(xùn)練,以減少人為或應(yīng)激對血液指標(biāo)的影響, 同時(shí)對樣本進(jìn)行血清皮質(zhì)醇檢測以判斷受應(yīng)激程度[14]。

表 4　嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞形態(tài)比較Tab. 4　The morphological differences between Neutrophil and Monocyte

魚類的血細(xì)胞一般包括紅細(xì)胞、血栓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞7大類[1]。本次結(jié)果顯示中華鱘外周血中包括6類細(xì)胞類型, 各類型細(xì)胞分別有不同種核型結(jié)構(gòu)或處于不同時(shí)期, 其中紅細(xì)胞比例最高, 白細(xì)胞和血栓細(xì)胞較少。其血細(xì)胞密度遠(yuǎn)低于黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)、羅非魚、軍曹魚(Rachycecentron canadum)、斜帶石斑魚(Epfnephelus coioides)、革胡子鯰(Clarias gariepinus)等[14—18]; 紅細(xì)胞密度較達(dá)氏鰉(Huso dauricus)、高首鱘、歐洲鰉、納氏鱘等鱘魚低[3—7], 與史氏鱘接近[8], 而白細(xì)胞的密度較上述幾類鱘魚均低[3—8], 表明其抵抗力相對較弱。研究認(rèn)為魚類活動能力越強(qiáng), 紅細(xì)胞數(shù)比較高, 這與它們的生活習(xí)性相一致[19]。白細(xì)胞中以淋巴細(xì)胞為主, 數(shù)量最多, 其次是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞, 酸性粒細(xì)胞數(shù)量極少,這與多數(shù)淡水養(yǎng)殖魚類一致[19]。粒細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞, 這與達(dá)氏鰉、高首鱘、史氏鱘、淡水石斑(Cichlasoma managuense)等結(jié)果一致[2,6—8,20];而美國紅魚(Sciaenops ocellatus)、犬牙韁蝦虎魚(Amoya caninus)、斑點(diǎn)叉尾鲙(Ietalurus punetaus)、長鰭裸頰鯛(Lethrinus erythropterus)的外周血液中均發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞[2,21—23]。有學(xué)者認(rèn)為嗜堿性粒細(xì)胞的嗜堿性顆粒極易溶于水, 制片過程中易解體難見到[20], 也可能與發(fā)育的不同時(shí)期以及生活環(huán)境有關(guān), 對此需進(jìn)一步研究。本結(jié)果顯示血栓細(xì)胞數(shù)量個(gè)體間波動極大, 受操作過程影響明顯, 且未見明顯的吞噬作用, 因此在白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)時(shí)不予列入。

不同年齡的血細(xì)胞組成結(jié)果顯示, 18齡中華鱘紅細(xì)胞和白細(xì)胞均與其他齡組有差異, 可能與其接近性成熟或處于性腺快速發(fā)育時(shí)期有關(guān), 該階段特殊營養(yǎng)需求及能耗水平導(dǎo)致血細(xì)胞組成差異性[1,2];野生成熟中華鱘、4齡中華鱘的白細(xì)胞組成分別與其他年齡組存在顯著差異, 分析野生成熟個(gè)體與人工養(yǎng)殖個(gè)體免疫機(jī)能差異顯著性, 而子二代中華鱘因技術(shù)、種質(zhì)等因素免疫力更弱[9,12], 這也為我們養(yǎng)殖中如何提高魚體免疫提出更高要求。在本次結(jié)果中11齡中華鱘血細(xì)胞差異性可能與樣本數(shù)量有關(guān), 需進(jìn)一步研究。

中華鱘外周血細(xì)胞的測量結(jié)果顯示單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞個(gè)體最大, 大小接近, 其次是嗜酸性粒細(xì)胞和大淋巴細(xì)胞, 酸性粒細(xì)胞的大小差異極小, 血栓細(xì)胞和小淋巴細(xì)胞最小。中華鱘血細(xì)胞個(gè)體明顯大于達(dá)氏鰉等幾種鱘魚[2—8], 以及黃顙魚、羅非魚、美國紅魚、淡水石斑等多數(shù)硬骨魚類[14,16,20,21]。脊椎動物中血細(xì)胞的大小與其進(jìn)化程度高低相一致, 一般認(rèn)為, 進(jìn)化地位越高等的動物, 紅細(xì)胞越小,數(shù)量越多, 因?yàn)榧t細(xì)胞體積的縮小會帶來表面積的增加, 起到提高呼吸機(jī)能的作用[15]。本次研究顯示中華鱘的細(xì)胞大于多數(shù)魚類及部分鱘魚, 細(xì)胞密度也較低, 表明其進(jìn)化程度較其他鱘魚更低, 顯示其古老性。

3.2　血細(xì)胞形態(tài)與功能

魚類成熟紅細(xì)胞為橢圓形的中心凸出的細(xì)胞,具有細(xì)胞核。對魚類的研究結(jié)果顯示原紅細(xì)胞到成熟紅細(xì)胞, 胞體及胞核均由大變小, 形態(tài)由圓形變?yōu)闄E圓形, 核固縮濃染[14—24], 中華鱘外周血紅細(xì)胞多為橢圓形成熟紅細(xì)胞, 偶爾見到圓形的原紅細(xì)胞。對軍曹魚研究發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞直接分裂現(xiàn)象但甚少[24], 高澤霞等[10]在1齡中華鱘中觀察到該現(xiàn)象, 本次研究中極少見到, 可見個(gè)體間或不同生長階段有差異, 說明紅細(xì)胞主要由造血器官產(chǎn)生后釋放入外周血液, 極少數(shù)靠直接分裂產(chǎn)生。中華鱘紅細(xì)胞個(gè)體較其他魚類大, 數(shù)量少, 表明其攜氧能力相對低,這與本作者關(guān)于中華鱘的行為活動緩慢的研究結(jié)論一致[25]。中華鱘紅細(xì)胞胞質(zhì)中?？梢妿讉€(gè)線粒體等細(xì)胞器, 表明其紅細(xì)胞的代謝活動水平相對較高, 其他魚類紅細(xì)胞胞質(zhì)中多無細(xì)胞器[26], 一般認(rèn)為是因?yàn)榧t細(xì)胞在成熟的過程中, 血紅蛋白逐漸增多, 為獲得更多的空間, 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器也逐漸退化消失, 這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可使紅細(xì)胞自身的代謝率大大降低, 利于相關(guān)氣體運(yùn)輸, 由此可見中華鱘紅細(xì)胞氣體運(yùn)輸能力相對較低, 進(jìn)化等級低。

淋巴細(xì)胞是免疫細(xì)胞的重要組成部分, 本次研究發(fā)現(xiàn)中華鱘的淋巴細(xì)胞分為大淋巴細(xì)胞和小淋巴細(xì)胞2大類, 除了細(xì)胞直徑顯著差別外, 在形態(tài)結(jié)構(gòu)上差別較小, 表面均有大量的偽足或突起, 且常見發(fā)生變形, 一般認(rèn)為吞噬反應(yīng)發(fā)生時(shí)細(xì)胞伸出偽足包圍細(xì)菌、衰老細(xì)胞等異物; W-G染色結(jié)果顯示大淋巴細(xì)胞核染色略淺, 胞漿更豐富, 且大淋巴細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡的幾率高于小淋巴細(xì)胞, 而空泡主要為吞噬物被溶解后形成, 也顯示大淋巴細(xì)胞的活躍性更高, 該分類法與一些研究結(jié)果一致[7,14,15]。有些研究將淋巴細(xì)胞分為大、小2類分別描述[7], 本次研究認(rèn)為中華鱘大小淋巴細(xì)胞可能代表了同種細(xì)胞的不同功能狀態(tài), 有學(xué)者表示當(dāng)處于靜息不活躍狀態(tài)的小淋巴細(xì)胞遇到抗原刺激時(shí), 將轉(zhuǎn)變成代謝活躍并能進(jìn)行增殖的大淋巴細(xì)胞, 此時(shí)細(xì)胞核增大, 染色質(zhì)致密, 細(xì)胞質(zhì)增多, 重新分裂和分化進(jìn)行免疫應(yīng)答[27], 可見不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)決定了其不同的功能。

中華鱘粒細(xì)胞主要有嗜中性和嗜酸性2類, 核型種類較多, 有些魚類中性粒細(xì)胞核型單一, 少見到3葉及以上[15], 分析與細(xì)胞功能機(jī)制的進(jìn)化地位有關(guān)系。中性粒細(xì)胞具有吞噬性, 存在于所有硬骨魚類血液中, 能做變形運(yùn)動, 參與機(jī)體的炎癥反應(yīng),大多數(shù)出現(xiàn)在炎癥的初期, 其功能可能是產(chǎn)生細(xì)胞因子和補(bǔ)充免疫細(xì)胞到達(dá)損傷處[15,28,29]。吞噬作用在本研究中多有發(fā)現(xiàn), 本次觀察中發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中特殊顆粒有吞噬作用, 這點(diǎn)未見報(bào)道。中華鱘嗜酸性粒細(xì)胞形狀極規(guī)則, 直徑變異系數(shù)小, 數(shù)量穩(wěn)定, 未見到有吞噬作用的細(xì)胞, 分析嗜酸性細(xì)胞并非中華鱘主要免疫細(xì)胞。一般認(rèn)為嗜酸性粒細(xì)胞與應(yīng)激反應(yīng)刺激—腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)有關(guān), 在寄生蟲感染和變態(tài)反應(yīng)性疾病中, 還可能與吞噬異物有關(guān)[30]。

單核細(xì)胞存在于所有脊椎動物中, 擔(dān)負(fù)著非特異性免疫的重要作用。中華鱘單核細(xì)胞胞核形狀多樣, 細(xì)胞有較多的胞突和胞質(zhì)含有空泡和吞噬物,說明其有較強(qiáng)的變形與吞噬能力, 這在鱖(Siniperca chuitsi)、鯉(Cyprinus carpio)、軍曹魚、歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)等多種魚類已得到證實(shí)[15,31—33]。本次研究顯示在外周血液中, 單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中出現(xiàn)吞噬作用的細(xì)胞所占比例高于淋巴細(xì)胞, 有研究顯示特異性反應(yīng)的淋巴細(xì)胞較非特異性的單核細(xì)胞和粒細(xì)胞發(fā)揮作用遲[34]。

魚類血栓細(xì)胞在功能上與哺乳動物的血小板類似參與凝血過程, 在鯉、鱖等魚類的血栓細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)有類似于血小板內(nèi)血栓粒的顆粒存在[31,32], 但兩者在形態(tài)和來源上卻迥然不同, 魚類血栓細(xì)胞形態(tài)和淋巴細(xì)胞相似, 它的來源還沒有定論[24], 中華鱘未見相關(guān)報(bào)道。中華鱘血栓細(xì)胞形態(tài)多樣, 胞質(zhì)中常形成細(xì)小的空泡結(jié)構(gòu), 這與軍曹魚等的研究結(jié)果較一致[26], 細(xì)小空泡及長偽足及黏連等超微結(jié)構(gòu)均表明其參與凝血功能, 未觀察到吞噬作用, 對于血栓細(xì)胞是否具有吞噬性存在爭議[27,35,36]。其他功能可能存在種的差異性, 有待進(jìn)一步研究。本次觀察到大量正在分裂或剛分裂形成的血栓細(xì)胞, 可見外周血中可直接形成。

魚類的血液學(xué)指標(biāo)值不僅與魚的種類、生活環(huán)境和營養(yǎng)有關(guān), 還與性別和健康狀況有關(guān), 本文未對不同性別、不同發(fā)育階段或疾病異常狀況下的血細(xì)胞組成和大小進(jìn)行研究, 需進(jìn)一步完成。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為中華鱘的健康監(jiān)測以及保育研究提供基礎(chǔ)依據(jù), 同時(shí)豐富動物血細(xì)胞研究相關(guān)領(lǐng)域。

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圖版Ⅰ　光鏡下血細(xì)胞形態(tài)圖PlateⅠ　The morphology of blood cells under Light Microscopic

圖版Ⅱ　電鏡下血細(xì)胞形態(tài)PlateⅡ　The morphology of blood cells under Electron Microscopic