草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1倍性分析和性腺發(fā)育特點(diǎn)

喬　慶　劉巧林,　肖調(diào)義,　趙　鑫　鄧亞林　王榮華　黎玉元　何美鳳

(1. 湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心, 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 長沙 410128;2. 水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心, 常德 415000)

草魚(Ctenopharyngodon idella), 屬鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科、草魚屬, 是我國淡水養(yǎng)殖中重要的養(yǎng)殖魚類之一, 年產(chǎn)量居四大家魚之首。由呼腸孤病毒引起的草魚出血病, 是造成草魚養(yǎng)殖過程中危害最大的一種, 其超高的死亡率[1], 嚴(yán)重制約著草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus),俗稱野草魚, 屬雅羅魚亞科、赤眼鱒屬。為了改良草魚的抗GCRV能力, 本團(tuán)隊(duì)自2010年起開展了草魚與赤眼鱒的屬間雜交試驗(yàn), 成功獲得了1—5齡草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1(以下簡稱雜交F1), 有試驗(yàn)證明赤眼鱒抗草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)感染能力優(yōu)于草魚[2]。目前, 有關(guān)雜交F1的研究主要集中在生物學(xué)特性[3—5]、形態(tài)[6]、生長[7]、營養(yǎng)[8,9]、肉質(zhì)[10]及其與親本的抗病能力的比較研究[11,12]等方面?，F(xiàn)有研究表明, 雜交F1在肉質(zhì)、抗病能力等方面具有一定的雜種優(yōu)勢。

雜交育種是水產(chǎn)動(dòng)物育種的重要方法之一, 雜種后代的遺傳特性和生育性能直接影響雜交方式的選擇。染色體是生物遺傳物質(zhì)的主要載體, 了解魚類染色體核型對研究物種的進(jìn)化、遺傳組成及變異等具有重要意義, 可為物種鑒定、雜交育種、性別決定等方面提供科學(xué)依據(jù)[13]。同一群體的DNA含量是恒定不變的, 具有物種特異性, 利用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞核DNA含量, 可快速且有效地鑒別物種倍型, 為生物的種質(zhì)鑒定和分子遺傳學(xué)提供科學(xué)依據(jù)[14]。有關(guān)草魚與赤眼鱒雜交后代的研究指出草魚(♀)與赤眼鱒(♂)雜交得到的F1具有較強(qiáng)的抗逆[4]; 赤眼鱒(♀)與草魚(♂)雜交得到的F1體細(xì)胞染色體為2n=48, 從細(xì)胞遺傳學(xué)角度證明赤眼鱒(♀)與草魚(♂)雜交F1為二倍體[15]; 黎玉元[16]對草魚(♀)與赤眼鱒(♂)雜交F1及其父母本染色體核型進(jìn)行了比較。目前, 關(guān)于草魚(♀)與赤眼鱒(♂)雜交F1染色體數(shù)目、DNA含量等的相關(guān)研究較少。魚類遠(yuǎn)緣雜交子代的生育性能與其性腺發(fā)育情況密切相關(guān), 研究性腺結(jié)構(gòu)有利于了解個(gè)體的生理發(fā)育狀況,可從表觀上判別雜交子代的繁育能力, 為物種的繁衍、保護(hù)、利用和開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。在遠(yuǎn)緣雜交中, 多數(shù)雜交后代的生育性能較為復(fù)雜, 研究者根據(jù)性腺顯微結(jié)構(gòu)將其分為不同發(fā)育類型： 如精巢型、卵巢型、脂肪型、兩性嵌合個(gè)體、卵巢發(fā)育不正常個(gè)體、卵巢發(fā)育正常個(gè)體、精巢發(fā)育異常個(gè)體和精巢發(fā)育正常個(gè)體等[17—19], 遠(yuǎn)緣雜交得到的大部分雜交后代是不育的, 但也不是絕對不育[20]。本試驗(yàn)擬通過研究雜交F1的染色體數(shù)量和核型, 檢測雜交F1細(xì)胞核DNA含量, 并對其性腺進(jìn)行觀察,以期從細(xì)胞水平、分子水平和個(gè)體水平闡明其遺傳特性和性腺發(fā)育情況, 探討遠(yuǎn)緣雜交后代的生育能力, 為雜交F1的后期選育和遠(yuǎn)緣雜交工作提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚來自湖南省瀏陽市烏龍漁場和湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地, 健康狀況良好, 雜交F1、草魚和赤眼鱒各10尾用于染色體制備; 雜交F1為15尾、草魚5尾和赤眼鱒5尾用于DNA含量測定; 雜交F1共124尾(1—5齡), 草魚5尾(3—5齡), 赤眼鱒11尾(1—5齡)用于解剖和切片觀察。所取樣本體重20—3420 g, 用于染色體制備和DNA含量測定的實(shí)驗(yàn)魚運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng), 解剖和切片觀察所用魚現(xiàn)場觀察和取樣。

1.2　染色體的制備

參照舒琥等[21]的染色體制備方法, 每尾魚以10 μg/g (魚體質(zhì)量)胸腔注射植物血球凝集素(PHA),12h后以15 μg/g再次注射, 3h后再以6 μg/g注射PHA, 此時(shí)在胸腔另一側(cè)以4 μg/g (魚體質(zhì)量)注射秋水仙素, 1h后解剖魚體取腎組織, 制備細(xì)胞懸液,0.075 mol/L KCl低滲處理40min, 卡諾固定液固定3次, 每次30min, 采用空氣干燥制片法制作染色體標(biāo)本。在顯微鏡下各選取100個(gè)分散良好的分裂相,統(tǒng)計(jì)各細(xì)胞中的染色體數(shù)目, 確定染色體總數(shù), 同時(shí)選取10個(gè)分散良好、長度適中(正中期)、著絲點(diǎn)清晰、染色體數(shù)目與上述統(tǒng)計(jì)眾數(shù)相一致的中期分裂相, 用Adobe Photoshop 6.0進(jìn)行放大, 測量染色體長短臂數(shù)值, 按照Levan等[22]提出的標(biāo)準(zhǔn)對染色體進(jìn)行配對和排列, 完成草魚、赤眼鱒及雜交F1核型圖。

1.3　DNA含量測定

在魚體尾靜脈處用含抗凝劑的注射器采血0.2 mL, 用德國Partec Gmbh提供的500 μL DAPI染液(用于細(xì)胞核著色)中加入500 μL血液和抗凝劑的混合物, 避光反應(yīng)5—10min, 經(jīng)20 μm尼龍濾器(德國Partec GmbH提供)過濾, 用德國生產(chǎn)的Partec流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品檢測。雞(Gallus domesticus)血采自翅膀靜脈, 處理方法同上。

以雞的紅細(xì)胞DNA含量(2.50 pg)作對照標(biāo)準(zhǔn)。DNA絕對含量計(jì)算公式如下： P1=P2×E2/E1。式中： P1表示檢測魚DNA絕對含量(pg), P2表示標(biāo)準(zhǔn)雞DNA絕對含量(2.50 pg/N), E1表示雞紅細(xì)胞熒光值, E2表示檢測魚紅細(xì)胞熒光值。按照耿波等[23]提出的用DNA指數(shù)(DI)判別物種倍性的方法, 以已知草魚為參照, 對雜交F1倍性進(jìn)行判定。

1.4　性腺組織觀察

解剖前對每尾魚進(jìn)行拍照編號, 測量魚體體長、全長和體重, 取鱗片; 解剖后稱取完整性腺重和去內(nèi)臟重, 觀察并記錄發(fā)育特征, 計(jì)算性腺成熟指數(shù)。剪取新鮮性腺中部組織, 置于含AFA固定液的10 mL離心管中固定24h, 期間更換一次固定液。配制所需各種試劑, 溶蠟(反復(fù)融化3次); 用微流水沖洗固定好以后的樣品過夜, 第二天取出沖洗后的性腺組織塊進(jìn)行修整, 使大小均勻、橫切面平整,再進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與粘片、脫蠟、染色、脫水、透明等處理, 封片后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2　結(jié)果

2.1　染色體核型

經(jīng)統(tǒng)計(jì), 雜交F1及其親本的染色體眾數(shù)均為48條, 其中雜交F1染色體數(shù)為48條的細(xì)胞出現(xiàn)頻率為73%, 親本草魚及赤眼鱒分別為62%和71%(圖 1)。

根據(jù)Levan等[22]標(biāo)準(zhǔn)對雜交F1及其母本草魚和父本赤眼鱒的染色體進(jìn)行分類, 得到各自的染色體核型公式(表 1、圖 2)。結(jié)果表明, 雜交F1染色體數(shù)目與親本保持一致, 染色體類型由中部著絲點(diǎn)(m)、近中部著絲點(diǎn)(sm)以及近端部著絲點(diǎn)(m)三種類型構(gòu)成, 無端部著絲點(diǎn)(t)、異型性染色體、次縊痕及隨體等結(jié)構(gòu), 1—2對染色體類型的配比與親本有差異, 臂數(shù)相對一致。

2.2　草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1的DNA含量測定

以DAPI作熒光染料, 應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析草魚、赤眼鱒和雜交F1血細(xì)胞DNA結(jié)果。草魚熒光強(qiáng)度為(50.40±7.31), 赤眼鱒熒光強(qiáng)度為(43.50±6.50), 雜交F1熒光強(qiáng)度為(46.2±10.81)。以雞血細(xì)胞DNA絕對含量2.30 pg作標(biāo)準(zhǔn), 計(jì)算出草魚絕對DNA含量為(3.50±0.66), 赤眼鱒絕對DNA含量為(3.02±0.48), 雜交F1絕對DNA含量為(3.21±0.61)(表 2)。

5尾草魚DNA： 15尾雜交F1DNA約為1∶0.92,5尾赤眼鱒DNA： 15尾雜交F1DNA約為1∶1.06。DNA指數(shù)[23](DI)指出, 當(dāng)一組細(xì)胞DNA平均含量與正常細(xì)胞相比較的數(shù)值介于1±0.1時(shí), 該細(xì)胞為正常二倍體細(xì)胞。因此, 以已知二倍體草魚和赤眼鱒與雜交F1對比分析, 可以判別出雜交F1為二倍體。

2.3　性腺觀察

圖 1　雜交F1及其親本染色體數(shù)目Fig. 1　Number of chromosomes of the hybrid F1 and its parents

表 1　雜交F1及其親本染色體核型結(jié)果Tab. 1　Karyotype of chromosomes for the hybrid F1 and its parents

從2015年12月到2016年6月, 隨機(jī)采取124尾雜交F1, 繁殖季節(jié)采樣84尾, 非繁殖季節(jié)采樣40尾, 經(jīng)性腺解剖觀察和組織切片鑒定, 樣本中雌性18尾,雄性56尾, 雌雄比約為1∶3, 另50尾個(gè)體無法確認(rèn)性別; 通過觀察鱗片鑒定出可判斷性別的個(gè)體的年齡, 并統(tǒng)計(jì)樣本數(shù)目(表 3)。其中, 2齡和5齡雜交F1的雌雄比為1∶3, 3齡和4齡雜交F1的雌雄比約為1∶3(1齡肉眼及切片無法分辨雌雄)。

卵巢解剖觀察肉眼觀察3齡以上雜交F1多數(shù)卵巢兩側(cè)大小均一, 淺粉色、扁帶狀, 卵粒較為飽滿, 繁殖季節(jié)擠壓腹部有卵粒流出; 少數(shù)卵巢發(fā)育不良, 兩側(cè)不對稱, 卵粒稀少, 形態(tài)極為扁平, 組織周圍附著大量脂肪。同期同齡赤眼鱒卵巢發(fā)育均勻, 呈粉紅色, 卵粒充實(shí), 輕輕擠壓便有卵粒產(chǎn)出。繁殖季節(jié)15尾雌性雜交F1性腺指數(shù)(GSI)均值為(1.57±0.01), 同時(shí)期雌性赤眼鱒性腺指數(shù)均值為(18.33±3.62)。

圖 2　雜交F1及其親本染色體核型圖Fig. 2　The karyotype of the hybrid F1 and its parents

表 2　流式細(xì)胞儀檢測草魚、赤眼鱒及其雜交F1 DNA含量Tab. 2　DNA content of the hybrid F1 and its parents by flow cytometry

表 3　雜交F1、草魚和赤眼鱒各年齡階段及其相應(yīng)樣本數(shù)Tab. 3　Number of samples of the hybrid F1 and its parents

組織切片光鏡下觀察, 繁殖季節(jié)3—5齡雜交F1卵巢分為兩種類型： 正常發(fā)育型, 可看到Ⅰ—Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞(圖版Ⅰ-1); 異常發(fā)育型, 細(xì)胞階段發(fā)育均正常, 到第Ⅴ時(shí)相, 卵黃顆粒減少, 油滴增加(圖版Ⅰ-2、3), 出現(xiàn)無卵黃空洞狀卵細(xì)胞(圖版Ⅰ-4)。雜交F1中, 同時(shí)期同個(gè)體有正常成熟卵細(xì)胞和異常成熟卵細(xì)胞(圖版Ⅰ-4); 同時(shí)期與同齡赤眼鱒卵巢相比, 部分雜交F1卵巢與之同步(圖版Ⅰ-1、5), 部分發(fā)育緩慢(圖版Ⅰ-6、7)。

經(jīng)解剖觀察和切片鑒定雜交F1卵巢, 繁殖季節(jié)中將其分為兩種類型： 正常發(fā)育型和異常發(fā)育型,其中10尾正常發(fā)育, 5尾異常發(fā)育, 分別占繁殖季節(jié)雌性個(gè)體的66.67%和33.33%, 比例為2∶1。非繁殖季節(jié)雌性個(gè)體無法判斷發(fā)育是否正常, 從切片效果看, 2齡開始出現(xiàn)第Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞, 此階段2—4齡卵細(xì)胞中只有卵原細(xì)胞、第Ⅰ時(shí)相卵母細(xì)胞、第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞和第Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞三種類型(圖版Ⅰ-8—10)。

精巢解剖觀察解剖3—5齡雄性雜交F1, 兩側(cè)精巢粗細(xì)不均勻, 呈不對稱斷帶狀, 粉紅色或暗紅色, 繁殖期擠壓雄魚腹部, 始終無個(gè)體有精液流出。同期同齡草魚和赤眼鱒精巢對稱發(fā)育, 乳白色,輕輕擠壓有大量精液流出。繁殖季節(jié)36尾雄性雜交F1性腺指數(shù)(GSI)均值為0.87±0.003, 同時(shí)期雄性赤眼鱒性腺指數(shù)均值為1.76±0.39。

切片組織光鏡下, 1—5齡雜交F1精巢中有許多精小葉, 精小葉中的精小囊內(nèi)有初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞和精子細(xì)胞, 無成熟精子(圖版Ⅱ-1—5)。同期與同齡草魚和赤眼鱒精巢結(jié)構(gòu)相比,精細(xì)胞類型基本一致, 在親本中同樣未觀察到成熟精子。相同倍數(shù)下, 雜交F1精巢中的精小囊個(gè)數(shù)較親本多, 精子細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于親本, 部分個(gè)體多為結(jié)締組織, 精細(xì)胞量極少(圖版Ⅲ-6—11)。

性別待定部分雜交F1性腺不明顯, 被脂肪組織覆蓋, 外部形態(tài)無法判斷性別, 固定樣品多為脂肪部分, 在光鏡下幾乎觀察不到性腺, 多為脂肪組織和血管(圖版Ⅳ-1-4), 無法判斷雌雄。

3　討論

3.1　草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1的倍性分析

染色體是生物遺傳物質(zhì)的主要載體, 染色體的數(shù)目、形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征代表一個(gè)物種的種屬特性,具有穩(wěn)定性, 鑒定物種倍性最直觀準(zhǔn)確的方法是染色體核型分析。流式細(xì)胞儀具有制樣簡單、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性高等特點(diǎn), 現(xiàn)已成為分析DNA含量和鑒定倍性的常用方法[24—26]。草魚、赤眼鱒及雜交F1核型和倍性結(jié)果同昝瑞光等[27]、舒琥等[28]、金萬昆[15]研究一致, 染色體總數(shù)2n=48, 為二倍體個(gè)體, 核型和臂數(shù)略有差異, 可能是由藥物濃度、處理時(shí)間或地理因素引起核型略有差異[29]。魚類遠(yuǎn)緣雜交后代的存活主要取決于親本間的相容性, 一般屬種間雜交的相容性較強(qiáng), 如紅鯽(Carassius auratus red variety, ♀)×湘江野鯉(Cyprinus carpio,♂)[30,31]、方正銀鯽(Carassius auratus, ♀)×興國紅鯉(Cyprinus carpio var. Singuonensis, ♂)[32]、青魚(Mylopharyngodon piceus, ♀)×草魚(grass carp, ♂)[33,34]、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala, ♀)×翹嘴紅鲌(Erythroculter ilishaeformis, ♂)[35]等雜交均獲得了后代。金萬昆[36]指出, 當(dāng)父母本染色體數(shù)量相同或母本染色體數(shù)目大于父本時(shí), 兩者間的雜交是相容的, 可得到后代。本研究中草魚染色體數(shù)目與赤眼鱒相等, 均為48條, 兩者雜交獲得的后代經(jīng)染色體核型分析鑒定出其染色體數(shù)目與親本相同, 推測可能因草魚與赤眼鱒為同一亞科, 染色體間的相容性較高, 在減數(shù)分裂時(shí)正常形成配子, 正常受精, 從而使后代染色體數(shù)與親本保持一致。遠(yuǎn)緣雜交通常形成多種倍性后代, 如草魚與三角魴(Magalobrame Tarminalis)[37]、草魚與鳙魚(Aristichthys nobilis)[38]雜交產(chǎn)生三倍體子代, 鯉(Cyprinus carpio)和鯽(Carasstus anratus)雜交可形成異源四倍體[39]。在本研究中, 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測雜交F1細(xì)胞核DNA含量證實(shí)其為二倍體群體, 暫未發(fā)現(xiàn)三倍體個(gè)體, 說明雙親染色體在減數(shù)分裂過程中染色體行為可能為均等分配、均等結(jié)合, 形成二倍體子代。

3.2　草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1的育性分析

肉眼觀察, 與同齡赤眼鱒相比雜交F1的1、2齡個(gè)體性腺基本未發(fā)育, 絕大多數(shù)呈細(xì)線狀或被脂肪覆蓋, 難以辨認(rèn), 該現(xiàn)象與1、2齡黃金鱸(Perca flarescens)與伊犁鱸(Perca achrenki)雜交后代[40]的性腺發(fā)育狀況相似; 3—5齡多數(shù)兩側(cè)不對稱, 雌雄性腺指數(shù)顯著低于同期赤眼鱒。切片發(fā)現(xiàn), 雜交F1卵巢和精巢的前期發(fā)育程序基本正常。雜交F1卵巢結(jié)構(gòu)與贛昌鯽(Carassius cuvieri, ♀ × Cyprinus carpio var. singuonensis, ♂)[18]既有相似又有不同, 相似之處表現(xiàn)為少數(shù)卵細(xì)胞發(fā)生卵黃消解, 不能正常發(fā)育成成熟卵子, 不同之處在于部分雜交F1的3—5齡卵巢可產(chǎn)生成熟卵細(xì)胞并繁殖后代。精巢內(nèi)精原細(xì)胞均可發(fā)育至精子細(xì)胞時(shí)期, 但無任何精子細(xì)胞完成變態(tài)發(fā)育成為精子, 與三倍體湘云鯽(Carassius auratus Triploid)[41]精巢結(jié)構(gòu)有相同點(diǎn)。生產(chǎn)中3—5齡雜交F1中三分之二的雌性可正常排卵受精產(chǎn)生子代, 性成熟年齡與草魚一致; 繁殖期擠壓高齡(3—5齡)雄性F1, 未發(fā)現(xiàn)排精個(gè)體, 這與興淮鯽[19]的性腺發(fā)育情況較為相似, 可能存在敗育現(xiàn)象。擠壓同齡草魚(♂)和赤眼鱒(♂)腹部, 不論個(gè)體大小均有卵子和精液排出。草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1性腺結(jié)構(gòu)分析和實(shí)踐研究證明, 部分雌性雜交F13齡開始性成熟, 具有可育性; 雄性直至5齡仍未發(fā)現(xiàn)排精現(xiàn)象, 也未發(fā)現(xiàn)精細(xì)胞異常, 只是暫無精子形成,其生育性能有待進(jìn)一步考究。

3.3　染色體核型與生育性能的相關(guān)性

染色體數(shù)目和核型不同的親本雜交時(shí)會(huì)引起彼此間某些等位基因組合發(fā)生紊亂[18], 染色體數(shù)目相同而核型不同的親本雜交時(shí)同樣會(huì)引起間個(gè)別等位基因組合發(fā)生紊亂, 致使胚胎發(fā)育受阻, 影響生物個(gè)體育性[42]。草魚與赤眼鱒為屬間雜交, 獲得的雜交后代證實(shí)兩親本的染色體間存在較強(qiáng)相容性。在可辨別性別的雜交F1群體中, 雜交F1群體中雌雄比為1∶3, 與親本自然群體比例有差異, 導(dǎo)致性別分化的具體原因有待進(jìn)一步探究。遠(yuǎn)緣雜交子代的性腺發(fā)育情況較為復(fù)雜, 本研究從個(gè)體和組織水平, 初步確定雜交F1雌性中存在正常個(gè)體和異常個(gè)體, 推測可能是親本間的某個(gè)等位基因存在某種抑制或干擾, 導(dǎo)致在不同子代個(gè)體中基因的表達(dá)有差異。從目前來看, 草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1的性腺發(fā)育具有復(fù)雜性, 今后可從性別相關(guān)基因的表達(dá)、激素含量的高低以及利用SSR標(biāo)記等方面對其展開進(jìn)一步的深入研究。

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圖版 ⅠPlate Ⅰ

圖版 ⅡPlate Ⅱ

圖版 ⅣPlate Ⅳ