中華絨螯蟹MSTN基因SNPs多態(tài)性及與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

陳義培　吳　廉　陳曉雯　岳武成　黃　姝　王　軍　王成輝

(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin, MSTN), 又稱生長(zhǎng)分化因子8(Growth differentiation factor-8, GDF-8),是生物體內(nèi)廣泛表達(dá)的一種糖蛋白, 對(duì)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育起著負(fù)向調(diào)控[1]。該基因自從被發(fā)現(xiàn)后就引起了研究者的廣泛興趣, 生產(chǎn)出了“雙肌牛”、“超級(jí)鼠”[2,3]。在家畜的研究中發(fā)現(xiàn), MSTN基因多態(tài)性與豬的生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀等存在關(guān)聯(lián)[4—6]; 該基因的多態(tài)性與南陽牛的體高、胸圍等性狀也存在顯著相關(guān)性[7]。隨后該基因在水產(chǎn)動(dòng)物的研究也越來越多, 包括生產(chǎn)出身體增大的模式魚類斑馬魚[8]和青鳉[9], 以及非模式魚類的標(biāo)記與性狀關(guān)聯(lián)分析等[10]。在水生甲殼動(dòng)物, MSTN基因的研究主要集中在基因的克隆與表達(dá)方面[11—14], 而與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性研究很少, 如Zhou等[15]報(bào)道了墨吉明對(duì)蝦MSTN基因的SNP與體長(zhǎng)、體質(zhì)量的顯著相關(guān)性。當(dāng)前,MSTN基因已應(yīng)用于育種領(lǐng)域, 培育出了軀體增大,肌肉量增加的陸生和水生動(dòng)物[16—18]。深入研究水生甲殼動(dòng)物中MSTN基因的結(jié)構(gòu)特性對(duì)豐富甲殼動(dòng)物產(chǎn)業(yè)育種手段具有指導(dǎo)意義。

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)作為一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水生甲殼動(dòng)物, 在整個(gè)生長(zhǎng)過程中需要經(jīng)歷18—21次蛻殼。中華絨螯蟹在蛻殼后首先是吸收水分, 然后逐漸被肌肉組織所代替[19]。當(dāng)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育至一定程度時(shí), 進(jìn)行下一次蛻殼。我們推測(cè), 肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)于刺激中華絨螯蟹的蛻殼可能發(fā)揮了較為重要的作用。因而, 開展中華絨螯蟹MSTN基因的研究, 不僅對(duì)甲殼動(dòng)物的蛻殼生長(zhǎng)研究有較好的科學(xué)價(jià)值, 而且對(duì)于甲殼動(dòng)物育種(如分子育種)也有較好的指導(dǎo)意義。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms, SNP)是基因組上單個(gè)核苷酸產(chǎn)生的堿基變異, 其具有分布數(shù)量多、多態(tài)性豐富等特點(diǎn), 是繼微衛(wèi)星分子標(biāo)記之后又一重要的分子遺傳標(biāo)記。該標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、遺傳多樣性研究和動(dòng)植物育種等領(lǐng)域[20—24]。本研究擬對(duì)不同來源具有不同遺傳背景的中華絨螯蟹MSTN基因的SNP進(jìn)行分型, 探討不同基因型與生長(zhǎng)性狀(體重、殼長(zhǎng))的相關(guān)性, 以期為我們中華絨螯蟹的良種選育或分子育種提供相關(guān)候選標(biāo)記。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)材料包括3大類樣本, 第一類是本實(shí)驗(yàn)室的中華絨螯蟹育種群體(剛完成生殖蛻殼的A、B選育系及其正反雜交子一代, 體重規(guī)格86.2—194.9 g, 數(shù)量120只), 簡(jiǎn)稱育種群體; 第二類是選自2010、2012、2014三個(gè)年度的全國河蟹大賽參賽樣本, 體重規(guī)格207.0—611.3 g, 數(shù)量124只, 簡(jiǎn)稱大賽群體; 第三類是來自長(zhǎng)江、黃河等水系的野生群體, 體重規(guī)格49.0—260.5 g, 數(shù)量77只, 簡(jiǎn)稱野生群體。每個(gè)樣本用SCOUT SE型電子天平(精確0.1 g)稱量表面凈水的蟹體重, 用游標(biāo)卡尺(精確0.01 mm)測(cè)量每只樣本的殼長(zhǎng)。性狀測(cè)量后, 剪取第二步足長(zhǎng)節(jié)的肌肉用無水乙醇浸泡, 常溫保存, 用于提取DNA。

1.2　基因組DNA的提取及檢測(cè)

采用飽和氯化鈉法提取肌肉中的DNA[25]。提取的DNA利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè), 并用核酸蛋白儀檢測(cè)儀(Bio-Rad Smartspic plus)測(cè)定DNA純度, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3　MSTN基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)中華絨螯蟹MSTN基因序列[26](GenBank：EU650662.1), 采用Primer Premier 5.0[27]軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(F： 5′-GCACGGATGTCCTCTACTT-3′, R：5′-GGGTCTGGCTACCTTGAA-3′), 然后交上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積為50 μL： 包括25 μL 2×Taq PCR MasterMix (天根生化科技有限公司), 正反引物(0.2 μmol/L)各2.5 μL,DNA模板2 μL, ddH2O 18 μL。反應(yīng)程序： 94℃預(yù)變性3min、94℃變性30s、56.5℃退火30s、72℃延伸60s, 35個(gè)循環(huán), 最后72℃再延伸5min, 4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 檢測(cè)有單一條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)軟件BioEdit進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn), 該引物擴(kuò)增產(chǎn)物獲得3個(gè)SNP位點(diǎn), 應(yīng)用此引物對(duì)所有樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序。

1.4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

首先采用Popgene 32(version 3.2)[28]軟件計(jì)算各類樣本的有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)等遺傳參數(shù), 了解SNP位點(diǎn)在群體中的分布特性。然后應(yīng)用SPSS20.0[29]軟件的一般線性模型(General linear model, GLM)進(jìn)行SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀(體重、殼長(zhǎng))的關(guān)聯(lián)性分析, 所構(gòu)建的線性模型如下：

式中, Yij為個(gè)體生長(zhǎng)性狀表型值; μ為群體均值; Si為SNP標(biāo)記的基因型效應(yīng), eij為隨機(jī)殘差。

2　結(jié)果

2.1　MSTN基因SNP位點(diǎn)分型

應(yīng)用該引物對(duì)321個(gè)中華絨螯蟹的MSTN基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序, 經(jīng)BioEdit編輯后與NCBI斑馬魚該基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 擴(kuò)增到的序列為斑馬魚第3外顯子區(qū)域。進(jìn)一步分析序列的核苷酸變異后發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP (起始密碼子為起點(diǎn), C714T、G729A、G753T)突變位點(diǎn), 均為同義突變, 分別命名為S1、S2、S3。通過讀取突變位點(diǎn)的測(cè)序峰值進(jìn)行等位基因的純雜合分型, TC基因型峰值圖為T/C套峰,GA基因型峰值圖為G/A套峰, GT基因型峰值圖為G/T套峰; 峰值圖為單峰的均為對(duì)應(yīng)基因型的純合子。

2.2　MSTN基因SNP位點(diǎn)的多態(tài)性分析

本研究3個(gè)位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度與期望雜合度基本相等, 經(jīng)χ2檢驗(yàn), 均處于Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05), 具體遺傳變異情況如表1所示。根據(jù)中度多態(tài)性原則(0.25＜PIC＜0.50), 3個(gè)群體中3個(gè)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)為中、高度多態(tài)性(PIC＞0.25)。

從3個(gè)SNP位點(diǎn)在3個(gè)群體中的基因型頻率和基因頻率(表2)看, TT基因型在3個(gè)群體的S1位點(diǎn)中均占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位, 等位基因T是為優(yōu)勢(shì)基因; 同樣,AA為S2位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型且等位基因A的頻率高于G, TT為S3位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型且等位基因T占優(yōu)勢(shì)地位。由此我們推測(cè)S1、S2、S3三個(gè)突變位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)基因分別為TT、AA、TT和T、A、T。

2.3　MSTN基因SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

對(duì)3個(gè)SNP位點(diǎn)共9種基因型分別與中華絨螯蟹的生長(zhǎng)性狀(體重、殼長(zhǎng))進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)(表3), S1位點(diǎn)的生長(zhǎng)性狀在3個(gè)群體和總?cè)后w中均存在一致性的顯著差異(P＜0.05), 即TT基因型的體重、殼長(zhǎng)顯著大于TC、CC基因型, 而S2、S3這兩個(gè)SNP位點(diǎn)均沒有表現(xiàn)出這種規(guī)律性。將3個(gè)位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型S1(TT1)、S2(AA2)、S3(TT3)分別兩兩組合后發(fā)現(xiàn)(表4), AA2×TT3組合的生長(zhǎng)效果最差, 顯著低于其他基因型組合TT1×AA2和TT1×TT3(P＜0.05)。3種基因型組合TT1×AA2×TT3的平均生長(zhǎng)規(guī)格雖最大, 但與基因型組合TT1×AA2和TT1×TT3沒有顯著的生長(zhǎng)差異(P＞0.05)。

表1　中華絨螯蟹三群體MSTN基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab. 1　Genetic parameters of three SNP sites in the MSTN gene from three populations of Chinese mitten crab

表2　中華絨螯蟹三個(gè)群體MSTN基因SNP位點(diǎn)的等位基因及基因型頻率Tab. 2　Genotype and allele frequency of three SNP sites in the MSTN gene from the three populations of Chinese mitten crab

表3　中華絨螯蟹三群體MSTN基因的SNP位點(diǎn)基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab. 3　The association of SNP polymorphisms in MSTN gene with growth traits from three populations of Chinese mitten crab

表4　中華絨螯蟹三群體MSTN基因不同SNP位點(diǎn)組合的生長(zhǎng)性狀比較Tab. 4　The growth traits of different SNP genotype combinations in MSTN gene from the three populations of Chinese mitten crab

3　討論

MSTN基因作為肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的直接調(diào)控基因, 其SNP特性自發(fā)現(xiàn)以來, 在陸生肉用動(dòng)物中的研究越來越豐富。如不同研究者在多種陸生動(dòng)物(豬、牛、雞等)[30—36]中均發(fā)現(xiàn)了該基因的SNP特性, 并通過大量數(shù)據(jù)闡明了該基因作為肉用動(dòng)物分子輔助標(biāo)記育種方式的可行性。近年來該基因在水生動(dòng)物中的研究也越來越普遍, 在魚類(草魚Ctenopharyngodon idellu、大黃魚Pseudosciaena crocea、大口黑鱸Micropterus salmoides、尼羅羅非魚Oreochromis niloticus)[37—39]以及軟體動(dòng)物和貝類(海參Apostichopus japonicus、海灣扇貝Argopecten irradians、蟶子Sinonovacula constricta)[40—41,43,47]中的研究也越來越多。本實(shí)驗(yàn)通過直接測(cè)序?qū)χ腥A絨螯蟹的MSTN基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型, 發(fā)現(xiàn)了第一外顯子上3個(gè)位點(diǎn)的堿基突變(C714T、G729A、G753T), 但均屬于同義突變。這些位點(diǎn)的SNP特性和上述水產(chǎn)動(dòng)物有所不同, 大黃魚中是第一外顯子發(fā)生多處非同義突變, 大口黑鱸的突變位于啟動(dòng)子區(qū)域, 而海參的突變位點(diǎn)又在MSTN的5′非編碼區(qū)和編碼區(qū)均有分布[37—39]。雖然不同水生動(dòng)物的MSTN基因的SNP特性具有差異, 但其都和生長(zhǎng)性狀具有相關(guān)性, 這說明MSTN在陸生動(dòng)物和水生動(dòng)物的分子輔助標(biāo)記育種中具有普遍性。

目前MSTN在水生甲殼動(dòng)物(蝦、蟹)中的研究也逐漸深入, Zhou等[15]對(duì)墨吉明對(duì)蝦的MSTN基因進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn)3個(gè)同義突變和8個(gè)非同義突變,并分析得出其和生長(zhǎng)性狀的顯著相關(guān)性。Covi等[44]在黑背陸地蟹的大螯肌肉組織中發(fā)現(xiàn), MSTN的高表達(dá)和骨骼肌中的蛋白合成量具有顯著負(fù)相關(guān)性。以上研究說明該基因在蝦蟹中具有和哺乳動(dòng)物相同或者相似的功能, 對(duì)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用。然而也有部分學(xué)者通過基因功能研究等手段發(fā)現(xiàn)該基因和陸生動(dòng)物以及其他水生動(dòng)物的不同特性, 如De Santis等[45]以及Lee等[46]分別對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦的MSTN進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn)敲降該基因會(huì)顯著降低實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)速率, 認(rèn)為MSTN在對(duì)蝦的生長(zhǎng)發(fā)育過程中可能為有別于其他動(dòng)物的正調(diào)控因子。雖然不同學(xué)者對(duì)蝦蟹類MSTN基因的研究結(jié)果不盡相同, 但是作為水生甲殼動(dòng)物的代表性動(dòng)物(蝦蟹)其生長(zhǎng)特性本身就和其他動(dòng)物有所差異。甲殼類的生長(zhǎng)發(fā)育和蛻殼活動(dòng)是相互耦合的[44], 蝦蟹類MSTN的功能可能和蛻殼活動(dòng)相互聯(lián)系, MSTN可能受到蛻皮激素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[48]。因此, 在甲殼動(dòng)物中, MSTN基因的多態(tài)性作為生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記輔助選育是可行的, 但是該基因在甲殼動(dòng)物中對(duì)肌肉發(fā)育的具體調(diào)控功能還需要結(jié)合甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)進(jìn)一步深入研究。

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