池蝶蚌STAT基因的克隆及功能分析

舒福興　周　偉　盛軍慶　王軍花　王小敏　高　沁　洪一江

(1. 南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西省水產(chǎn)動物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330031; 2. 南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南昌 330031)

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducer and activator of transcription, STAT)是一種胞漿蛋白, 控制很多重要的生物應(yīng)答, 進(jìn)化上功能保守[1],廣泛參與細(xì)胞分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等眾多細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑[2]。Awersik等[3]對果蠅的性腺研究發(fā)現(xiàn)JAK激酶激活的STAT通路與性別有關(guān); 在哺乳動物中鑒定出來有7個(gè)750—850個(gè)氨基酸STAT蛋白[4]。STAT含有4個(gè)功能保守結(jié)構(gòu)域：STAT蛋白互作結(jié)構(gòu)域(STAT protein, protein interaction domain, STAT_int)、α-螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域(STAT protein, all-alpha domain, STAT_alpha)、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(STAT protein, DNA binding domain, STAT_bind)、SH2結(jié)構(gòu)域(Src homology 2),同時(shí)還具有高度分化及主要差異部位的羧基末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(Carboxy-terminal transcriptional activation domain, TAD)。

付友等[5]在鯉魚的組織差異性表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)STAT 1/2/4在頭腎和脾臟中表達(dá)最高; Ray等[6]的研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚暴露于砷刺激下TLR/Socs等基因都涉及JAK/STAT招募; Hanson等[7]研究發(fā)現(xiàn)雌激素刺激虹鱒10—30min后, JAK/STAT信號通路快速被抑制; Wu等[8]研究發(fā)現(xiàn)黃顙魚JAK/STAT信號通路在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)瘦素; 蘭江風(fēng)等[9]研究發(fā)現(xiàn)在甲殼類動物中弧菌刺激能夠引起STAT的磷酸化, 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)弧菌表面分子脂多糖(LPS)可以誘發(fā)STAT的磷酸化過程; Bathige等[10]研究發(fā)現(xiàn)盤鮑Ab-STAT5基因應(yīng)答革蘭氏陰性菌、病毒、脂多糖的刺激, 并推斷Ab-STAT5參與了盤鮑先天性免疫;Huang等[11]研究發(fā)現(xiàn)插核受傷的合浦珠母貝中Pf-STAT參與了病毒的免疫應(yīng)答; Zhang等[12]等研究光滑雙臍螺的STAT1和STAT2發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄因子參與了其對吸蟲的響應(yīng), 為動物免疫系統(tǒng)的進(jìn)化提供了新的視角; Canesi等[13]研究發(fā)現(xiàn)： 在異源細(xì)胞因子和細(xì)菌的刺激下, 紫怡扇貝血細(xì)胞通過酪氨酸激酶介導(dǎo)STAT-like家族成員開啟免疫應(yīng)答; 大量的研究表明STAT家族承擔(dān)著多種重要的功能, 然而在淡水育珠貝中鮮有報(bào)道。池蝶蚌是優(yōu)質(zhì)的淡水育珠蚌, 鑒于STAT基因在免疫及性別調(diào)控中的重要作用, 本文克隆了池蝶蚌STAT基因(HsSTAT)并對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 為選育抗病、優(yōu)產(chǎn)珠的池蝶蚌做前期工作。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

池蝶蚌取自江西省洪門水庫國家級池蝶蚌良種場。9只3齡健康蚌, 體型正常, 張閉有力, 體長(137.62±9.41) mm, 體重(260±10) g。實(shí)驗(yàn)室水族箱暫養(yǎng)1周, 水溫18—25℃, 每天換提前曝氣的自來水1次。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

RACE-PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室高通量測序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出HsSTAT的部分片段設(shè)計(jì)引物如表1, 由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

總RNA的提取與cDNA的合成從池蝶蚌血細(xì)胞中以Trizol法提取總RNA, 用于qPCR的RNA從10個(gè)組織中提取; 根據(jù)Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒的要求合成5′RACE-Ready cDNA和3′RACE-Ready cDNA。

HsSTAT序列的克隆和測序鑒定以UPM通用引物分別和5′、3′端的GSP引物, 分別用5′RACE-Ready cDNA和3′RACE-Ready cDNA為模板進(jìn)行RACE-PCR。反應(yīng)體系為： PrimeSTAR HS(Premix)12.5 μL, GSP引物 1 μL, UPM引物 1 μL, 模板 1 μL, ddH2O 9.5 μL, 共25 μL; 反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃預(yù)變性3min; 95℃變性10s, 55℃ 退火5s, 72℃延伸30s, 35個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收, 切膠回收步驟按照OMEGA公司的DNA回收試劑盒說明進(jìn)行操作。由于PrimeSTAR酶的高保真性, 回收產(chǎn)物進(jìn)行加“A”反應(yīng)。反應(yīng)體系為： Taq 酶1 μL, 10×buffer 2 μL, dNTP 1 μL, 回收產(chǎn)物16 μL, 共20 μL;反應(yīng)條件為72℃孵育1h。將加“A”后的產(chǎn)物按照OMEGA產(chǎn)物純化試劑盒純化之后與pMD19-T載體連接, 轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌中; 培養(yǎng)12 h后挑取單克隆到1 mL AMP+終濃度為100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中, 37℃ 250 r/min培養(yǎng)9h; 菌液PCR驗(yàn)證后送上海生物工程技術(shù)有限公司測序。

生物信息學(xué)分析將測序后的序列片段經(jīng)過MEGA4軟件拼接之后在NCBI (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)中進(jìn)行全序列比對,ORF框的尋找, 氨基酸的序列推導(dǎo), 相應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)的分析, 氨基酸的同源比對, 用MEGA軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹, Bootstrap重復(fù)1000次。用在線軟件Prabi (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)對蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測; 用SWISS MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive/qVzz5X/models/)對蛋白序列進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測; 用GPSSUMO軟件對序列進(jìn)行小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)預(yù)測; 用GSP-Lipid 1.0對序列進(jìn)行蛋白棕櫚?；⒎峄?、N-端豆蔻酰化、香葉酰香葉酰化位點(diǎn)的預(yù)測; 用NetPhos 3.1(http：//www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/webface2.fcgi?jobid=57FA778700004B57B570D3E5&wait=20)在線軟件對序列的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。

表1　用于實(shí)驗(yàn)的引物信息Tab. 1　The primer information for experiments

亞細(xì)胞定位按照Barcia[14]的血細(xì)胞取樣方法抽取池蝶蚌血細(xì)胞用于培養(yǎng), 培養(yǎng)方法如下： 用注射器從池蝶蚌的閉殼肌抽取1 mL血液, 向血液中加入1%肝素鈉, 混勻, 放于100 μL ALS緩沖液中(葡糖糖20.8 g/L, 檸檬酸鈉 8 g/L, EDTA 3.36 g/L)輕輕混合均勻, 200 g/min離心5min收集細(xì)胞, 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)到105個(gè)/mL, 以混有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基及100ul雙抗溶液重懸血細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)移到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 置于25℃, 5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng); 以上述cDNA為模板, DW-F為上游引物, DW-R為下游引物, 反應(yīng)體系為： PrimeSTAR HS(Premix)12.5 μL, 引物各 1 μL, 模板 1 μL, ddH2O 9.5 μL, 共25 μL; 反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃預(yù)變性3min;95℃變性10s, 55℃ 退火5s, 72℃延伸30s, 35個(gè)循環(huán),獲得帶酶切位點(diǎn)的PCR HsSTAT-ORF產(chǎn)物。以限制性內(nèi)切酶XhoL I和 BamH I對帶酶切位點(diǎn)的產(chǎn)物和pEGFP-c1載體進(jìn)行雙酶切, 切割之后用Omega PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化, 最后用T4 DNA連接酶將切開的質(zhì)粒和HsSTAT-ORF產(chǎn)物連接過夜,測序鑒定正確后大量提取重組質(zhì)粒, 以沒有加入質(zhì)粒的池蝶蚌血細(xì)胞為空白對照, 以DNA∶轉(zhuǎn)染試劑體積=3 μg∶6 μL的比例轉(zhuǎn)染入準(zhǔn)備好的池蝶蚌血細(xì)胞中, 培養(yǎng)24h后在波長488 nm下利用倒置熒光顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位結(jié)果, 轉(zhuǎn)染效率=圖中發(fā)出熒光的細(xì)胞數(shù)量/圖中細(xì)胞的總數(shù)。

分子原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)用10 mL注射針抽取池蝶蚌血于1.5 mL離心管中, 取 10 μL適當(dāng)稀釋血液均勻涂抹于干凈的多聚賴氨酸處理過的載玻片上晾干, 3%H2O2室溫10min, 蒸餾水洗3次，每次5min; 暴露mRNA核酸片段： 切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶, 37℃消化10min, 原位雜交用PBS洗3次，每次5min, 蒸餾水洗1次，每次5min; 1%多聚甲醛室溫固定10min, 蒸餾水洗3次，每次5min; 用DEPC水按1∶200的比例稀釋雜交液, 每張切片滴加20 μL雜交液, 用蓋玻片蓋在切片上, 陰性對照以PBS代替雜交液, 恒溫箱41℃雜交過夜, 探針序列為TZ (上海生工合成); 37℃左右的2×SSC洗滌2次，每次5min,37℃左右的0.5×SSC洗滌15min, 37℃左右的0.2×SSC洗滌2次，每次15min; 原位雜交用PBS洗3次，每次5min, 甘油封片, 熒光顯微鏡下觀察。

池蝶蚌各組織中HsSTAT的表達(dá)分析混合提取3只池蝶蚌性腺、鰓、心臟、外套膜、腸、腎、肝胰腺、閉殼肌、血和斧足共10種組織的總RNA, 通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA完整性。將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA模板; 以β-actin為內(nèi)參基因。根據(jù)熒光定量試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行qRT-PCR檢測。20 μL PCR反應(yīng)體系為： SYBR 10 μL, 上、下游引物各0.4 μL, H2O 8.2 μL, 模板1 μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。反應(yīng)條件為： 95℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 58℃退火30s, 72℃延伸30s, 40個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。采用伯樂qPCR儀自帶的分析軟件以 2-ΔΔCt法進(jìn)行表達(dá)分析。

HsSTAT對SMCC-7721的增殖影響將SMCC-7721細(xì)胞密度達(dá)到80%—90%時(shí), 用0.05%胰蛋白酶分別消化單層細(xì)胞, 消化離心收集后, 將上清去掉, 加入2 mL完全培養(yǎng)基使其混勻, 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度, 終濃度為2×104個(gè)/mL; 用槍分別將細(xì)胞接種到3個(gè)96孔板中, 每孔加100 μL細(xì)胞懸液, 待細(xì)胞貼壁之后以轉(zhuǎn)染試劑∶質(zhì)粒=1 μL∶3 μg的比例轉(zhuǎn)染以VC-F和VC-R為引物構(gòu)成的重組質(zhì)粒pBIFCVC155-HsSTAT至細(xì)胞中, 同時(shí)設(shè)置空白對照組, 陰性對照組, 24h后向孔中加入10 μL的CCK8試劑(注意不要在孔中生成氣泡, 氣泡會影響OD值得讀數(shù)),迅速放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h, 之后用酶標(biāo)儀測試吸光度, 波長=450 nm, 最后按照如下公式進(jìn)行計(jì)算：

增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白組OD值×100%

實(shí)驗(yàn)組： 具有轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞、CCK8和培養(yǎng)基。

陰性對照組： 具有培養(yǎng)基和CCK8溶液和pBIFC-VC155空載體。

空白組： 具有沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、CCK8溶液和培養(yǎng)基。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)熒光定量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)數(shù)據(jù)通過伯樂熒光定量PCR儀自帶軟件用2-ΔΔCt進(jìn)行處理分析; 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔, 重復(fù)3次,以SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件, 配對T檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì), 顯著性設(shè)置為P＜0.05, 以EXCEL作圖。

2　結(jié)果

2.1　HsSTAT基因的全長序列分析

根據(jù)設(shè)計(jì)的引物獲得的5′-RACE PCR和3′-RACE PCR產(chǎn)物大小分別為261和448 bp。拼接的HsSTAT (GenBank ID：KY123702)全長為2752 bp,5′端121 bp, 3′端264 bp, ORF框2367 bp, 共編碼789個(gè)氨基酸。包含了4個(gè)經(jīng)典的結(jié)構(gòu)域, 在125—367 bp含有81個(gè)氨基酸的STAT_int, 542—1099 bp處, 含有186個(gè)氨基酸STAT_alpha, 1118—1849 bp之間, 含有244個(gè)氨基酸STAT_bind, 1820—2227 bp處含有136個(gè)氨基酸的SH2結(jié)構(gòu)域。BLAST分析顯示,所擴(kuò)增的序列為池蝶蚌的STAT基因的全長cDNA。

2.2　HsSTAT 基因序列的生物信息學(xué)分析

HsSTAT 蛋白氨基酸組成分析經(jīng)在線軟件ExPASy (http：//web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)推導(dǎo)出HsSTAT基因編碼788個(gè)氨基酸, 預(yù)測分子量為90.024 kD, 理論等電點(diǎn)為5.75, 該蛋白顯弱酸性。該序列中氨基酸的占有比例Var最高為12.9%, Lys最低為0.5%。

HsSTAT蛋白親水性與疏水性分析將Hs-STAT的蛋白序列在ExPASy (http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl?1)分析, 參數(shù)采用Hphob/Kyte＆Doolitle標(biāo)度。進(jìn)行親疏水分析發(fā)現(xiàn)疏水性氨基酸(Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Val、Pro)占39.8%, 親水性蛋白(Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Ser、Thr、Tyr)占60.2%, 平均疏水性指數(shù)為-0.531, HsSTAT為親水性氨基酸。

HsSTAT蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析將HsSTAT蛋白序列導(dǎo)入NCBI Protein BLAST, 網(wǎng)址為： https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome,比對之后發(fā)現(xiàn)其具有4個(gè)STAT經(jīng)典的結(jié)構(gòu)域。

HsSTAT蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析將HsSTAT蛋白序列在Prabi (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)分析發(fā)現(xiàn)α螺旋含46.83%、β折疊含8.5%、延伸鏈占15.36%、無規(guī)則卷曲占29.31%; α螺旋在整個(gè)序列都有分布, 但是主要集中在這個(gè)序列的前段及中部, 無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β折疊分布在全序列中, 但主要集中在中后區(qū)。

HsSTAT蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測通過SWISS MODEL對HsSTAT氨基酸的三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測顯示在相應(yīng)的氨基酸位置上的確出現(xiàn)了用Prabi在線軟件預(yù)測的二級結(jié)構(gòu), 而且在NCBI中比對的HsSTAT_int、HsSTAT_alpha、HsSTAT_bind、SH2四個(gè)結(jié)構(gòu)域在預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)域中也存在; 這說明預(yù)測的HsSTAT蛋白的三級結(jié)構(gòu)具有一定的可信度。

HsSTAT蛋白的棕櫚酰化、法尼基化、N端豆蔻?；⑾闳~酰香葉?；稽c(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測通過GPS-lipid 1.0 對HsSTAT蛋白的棕櫚?；⒎峄端豆蔻酰華、香葉酰香葉?；稽c(diǎn)進(jìn)行預(yù)測, 在274—288 bp處存在1個(gè)棕櫚?；稽c(diǎn), 位點(diǎn)信息為： LETIQSWCESLAEII。通過GPSSUMO軟件對HsSTATA氨基酸序列的小泛素化修飾進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)2個(gè)小泛素化位點(diǎn)和1個(gè)小泛素修飾作用位點(diǎn)(表2)。

2.3　HsSTAT基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對各個(gè)物種HsSTAT保守位點(diǎn)氨基酸使用頻率分析發(fā)現(xiàn)色氨酸(W)在保守位點(diǎn)上的使用頻率最高, 多個(gè)保守位點(diǎn)的使用頻率達(dá)到100%, 其次是苯丙氨酸(F), 這說明STAT基因在進(jìn)化的過程中依然保留著最原始的一些特征, 并且隨著物種的進(jìn)化選用了適合自身的氨基酸。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)各種類型的STAT比較保守, HsSTAT與光滑雙臍螺STAT5B和盤鮑的STAT5聚為一支, 和魚類、鳥類、靈長類不在一支, 這說明HsSTAT在進(jìn)化的過程中趨向保守(圖2)。

2.4　亞細(xì)胞定位分析

圖1　HsSTAT的三級結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1　Schematic diagram of the tertiary structure of HsSTAT

表2　GSP-SUMO軟件預(yù)測的HsSTAT蛋白序列的小泛素化修飾位點(diǎn)Tab. 2　Prediction of small ubiquitination modification sites in HsSTAT protein sequence from GSP-SUMO software

HsSTAT的亞細(xì)胞定位顯示, 在空白對照組中沒有出現(xiàn)熒光, HsSTAT在血細(xì)胞中的定位在細(xì)胞質(zhì)中(圖3), 熒光原位雜交FISH實(shí)驗(yàn)顯示, 在正常的池蝶蚌血細(xì)胞中HsSTAT-RNA主要存在于細(xì)胞核中, 在細(xì)胞質(zhì)中沒有發(fā)現(xiàn)雜交信號(圖4)。

圖2　HsSTAT系統(tǒng)進(jìn)化樹(三角形指示HsSTAT所在進(jìn)化位置)Fig. 2　Phylogenetic tree of HsSTAT system (triangle represents the position of HsSTAT)

2.5　池蝶蚌各組織中HsSTAT的表達(dá)分析

對池蝶蚌血細(xì)胞、鰓、肝胰腺、外套膜、腎、斧足、閉殼肌、性腺、腸、心臟十個(gè)組織中HsSTAT的表達(dá)進(jìn)行qPCR研究發(fā)現(xiàn)HsSTAT在所有的組織中均有表達(dá), 表達(dá)量從高到低的順序依次為肝胰腺＞腸＞鰓＞腎＞心臟＞性腺＞閉殼?。靖悖就馓啄ぃ狙?xì)胞(圖5)。

2.6　HsSTAT對SMCC-7721的增殖影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明(圖6), 設(shè)置空白對照增殖為100%, 與空白對照相比陰性對照組的增殖率為101%, 實(shí)驗(yàn)組增殖率為119%, 可見HsSTAT可以促進(jìn)SMCC-7721細(xì)胞系的增殖。

3　討論

3.1　生物信息學(xué)分析

HsSTAT首次在優(yōu)質(zhì)淡水育珠貝池蝶蚌中報(bào)道。通過對HsSTAT結(jié)構(gòu)域的預(yù)測以及與其他物種的氨基酸比對發(fā)現(xiàn)其含有STAT_int、STAT_alpha、STAT_bind、SH2四個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域。STAT_int是參與蛋白互作的結(jié)構(gòu)域, 當(dāng)細(xì)胞因子或生長因子與之結(jié)合時(shí), STAT特異的激活靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 而STAT_alpha和STAT_bind結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白與DNA的相互作用[15], 這暗示著HsSTAT具有典型的STAT的功能; 由于JAK和STAT家族成員較多, 承接信號來源廣泛, 因此JAK/STAT信號通路的研究成為最近幾年的研究熱點(diǎn)[16—19], HsSTAT是否涉及JAK/HsSTAT通路有待研究, 李菲菲等[20]報(bào)道STAT會被胞漿內(nèi)酪氨酸蛋白激酶分子Tec家族(非受體性酪氨酸激酶家族)調(diào)控。隨后有研究指出LITAF與胞漿中活化的STAT形成復(fù)合體在進(jìn)入細(xì)胞核啟動TNF-a、IL-2/6等細(xì)胞因子的表達(dá)[21]。這說明STAT家族基本上是在胞漿和細(xì)胞核中傳送生物信號, 這為研究HsSTAT的功能提供亞細(xì)胞水平上的啟示。

圖3　HsSTAT在血細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位(綠色熒光代表重組蛋白pEGFP-c1-HsSTAT的位置)Fig. 3　Subcellular localization of HsSTAT in hemocyte (green fluorescence represents the location of the recombinant protein pEGFP-c1-HsSTAT)

圖4　HsSTAT-RNA在正常血細(xì)胞中的定位Fig. 4　The localization of HsSTAT-RNA in normal hemocyte

圖5　HsSTAT在各個(gè)組織中的表達(dá)情況Fig. 5　The expression of HsSTAT in different tissues

圖6　HsSTAT對SMCC-7721細(xì)胞的增殖影響(“*”代表P＜0.05)Fig. 6　The effects of HsSTAT on proliferation of SMCC-7721 cells (“*”represent P＜0.05)

在對HsSTAT保守結(jié)構(gòu)域上氨基酸的使用頻率進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn), 色氨酸(W)在保守結(jié)構(gòu)位點(diǎn)上被非常高頻率的使用, 親疏水分析顯示蛋白是親水性蛋白, 磷酸化位點(diǎn)分析找出3個(gè)以酪氨酸(Y)為中心的催化位點(diǎn), 然而酪氨酸在HsSTAT整條序列的占有比例僅有2.6%, 與其他物種相同保守位點(diǎn)氨基酸的使用頻率相比較未見100%使用酪氨酸, 這似乎暗示著各物種的STAT基因進(jìn)化的過程中在保守位點(diǎn)上對酪氨酸的選擇具有差異性。雖然HsSTAT在進(jìn)化的過程中對酪氨酸的選擇頻率不高, 而且這些少數(shù)酪氨酸并不是都能和附近的氨基酸一起形成磷酸化位點(diǎn), 這暗示HsSTAT在進(jìn)化的過程中對酪氨酸激酶修飾的磷酸化位點(diǎn)有比較嚴(yán)格的要求。

蛋白的棕櫚?；揎椏梢哉{(diào)節(jié)蛋白的活性、穩(wěn)定性、膜融合及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn), 介導(dǎo)蛋白定位于亞細(xì)胞器參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號通路, 介導(dǎo)蛋白與蛋白、蛋白與脂質(zhì)的相互作用[22], 對HsSTAT進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)其存在棕櫚?；揎椢稽c(diǎn), 這暗示著HsSTAT具有從蛋白質(zhì)、磷脂基團(tuán)獲取信號的能力, 這個(gè)位點(diǎn)正好落在NCBI數(shù)據(jù)庫預(yù)測到的STAT_alpha結(jié)構(gòu)域中它們具有相似的作用, 不同的軟件對這段結(jié)構(gòu)域預(yù)測出相同的功能, 加大了可信度。

法尼基化使蛋白質(zhì)更容易結(jié)合細(xì)胞膜。在HsSTAT的氨基酸序列中未預(yù)測到N端豆蔻酰位點(diǎn), 因此預(yù)測HsSTAT可能不會存在于細(xì)胞膜上。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)pEGFP-c1-HsSTAT重組蛋白定位在細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)中與生物信息學(xué)的預(yù)測吻合, HsSTAT并不存在于細(xì)胞膜上[23]。

被香葉酰香葉?；揎椀牡鞍踪|(zhì)可以結(jié)合到細(xì)胞膜上, 一方面參與腫瘤的生長與增殖, 另一方面參與血管的形成, 腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[24]。HsSTAT氨基酸序列中沒有發(fā)現(xiàn)能被香葉酰香葉?；揎椀男蛄? Xiaoren Tang[21]的研究表明LITAF與STAT6進(jìn)入細(xì)胞核中誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)讓腫瘤細(xì)胞步入凋亡階段, 這與蛋白香葉酰香葉酰化的功能截然不同。

小泛素相關(guān)修飾物(Small ubiquitin-ralated modifier, SUMO)是一種泛素樣分子。SUMO化修飾的蛋白質(zhì)很穩(wěn)定, 可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)之間的相互作用、在核漿間的轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和轉(zhuǎn)錄活性等[25—29]。通過GPS-SUMO軟件中預(yù)測到HsSTAT中有2個(gè)SUMO化位點(diǎn)和1個(gè)SUMO作用位點(diǎn), 這暗示著HsSTAT可以攜帶某些蛋白進(jìn)入細(xì)胞核或者進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中, 而它自身并不會參與攜帶蛋白的降解。

對HsSTAT的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn), HsSTAT與光滑雙臍螺和盤鮑的STAT5/STAT5B聚為一支, 從進(jìn)化地位上符合池蝶蚌的進(jìn)化地位, 且HsSTAT可能為是HsSTAT5亞型。

3.2　HsSTAT各組織中的表達(dá)結(jié)果及其亞細(xì)胞定位

肝胰腺作為貝類重要的免疫器官, 其具有合成免疫相關(guān)蛋白的功能, 血細(xì)胞同樣是重要的免疫系統(tǒng)組成部分, 在正常的情況下, 血細(xì)胞中免疫有關(guān)的蛋白維持在較低水平有利于免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定,HsSTAT在肝胰腺中的高表達(dá)以及在血細(xì)胞中的低表達(dá)水平暗示HsSTAT或許在貝類的免疫防御中起著重要的作用。在HsSTAT的亞細(xì)胞定位中發(fā)現(xiàn)HsSTAT在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá), 這與生物信息學(xué)的預(yù)測基本吻合, 雖然在激光共聚焦下觀察到了細(xì)胞核,但是由于本實(shí)驗(yàn)中沒有使用DAPI進(jìn)行核染色加上轉(zhuǎn)染效率偏低, 因此還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HsSTAT是否在細(xì)胞核中表達(dá)。HsSTAT-RNA的雜交信號僅出現(xiàn)在血細(xì)胞核中, 我們結(jié)合HsSTAT在血細(xì)胞中表達(dá)量最低, 推測在正常血細(xì)胞中HsSTAT-mRNA很少進(jìn)行轉(zhuǎn)錄, 當(dāng)收到相關(guān)分子信號后, HsSTAT在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯, 攜帶JAK的細(xì)胞信號進(jìn)入細(xì)胞核中啟動相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)[30]。

3.3　HsSTAT促進(jìn)SMCC-7721增殖

本研究發(fā)現(xiàn)相對于空白對照組和陰性對照組,實(shí)驗(yàn)組顯著提高了SMMCC-7721的增值率。有研究證明下調(diào)STAT5可以抑制SMCC-7721增殖[31]和白血病惡性腫瘤的增殖[32], 結(jié)合上述生物信息學(xué)的結(jié)果HsSTAT可能為STAT5亞型, 行使著促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用。生物信息學(xué)中沒有預(yù)測到香葉酰香葉酰化修飾, 這似乎暗示HsSTAT不通過香葉酰香葉?；揎椡緩酱龠M(jìn)SMCC-7721的增殖。因此,HsSTAT作為外源物種的基因是由何種機(jī)制引發(fā)腫瘤細(xì)胞的增殖還有待挖掘。

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