絲素蛋白支架材料生物可控降解性的研究進展

王 進(綜述) 夏 軍(審校) 王思群 魏亦兵 陳飛雁 黃鋼勇 陳 杰 石晶晟 趙廣雷

(復旦大學附屬華山醫(yī)院骨科 上海 200040)

生物醫(yī)學領域組織工程技術的發(fā)展為組織、器官的修復、再生提供了新的方向和手段[1-3]。為尋找合適的生物支架材料,學者們做了大量的嘗試,包括金屬、生物陶瓷和生物聚合物類材料。但是,金屬材料的生物相容性及降解性仍存在問題;生物陶瓷類材料脆性高且降解速率不穩(wěn)定,如羥基磷灰石、磷酸三鈣等;而生物聚合物類材料機械性能較差,降解速度較快,如膠原、明膠和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolicacid,PLGA)等,這些缺陷都極大地限制了其在生物組織工程領域的應用[4-5]。

絲素蛋白作為一種天然材料,具有良好的生物相容性和一定的機械強度[6],已廣泛應用于生物醫(yī)學領域,如手術縫線、藥物緩釋材料[7]。絲素蛋白作為各種組織工程支架材料[8-11],主要應用形式有水凝膠[12]、薄膜[13-14]、納米纖維[15]及三維多孔支架[16]等。Fan等[17]先后在兔、豬體內應用絲素蛋白/骨髓間充質干細胞支架重建前交叉韌帶獲得成功,具有可靠的機械強度,能夠滿足實驗動物日常的活動需求。這些研究結果在一定程度上體現(xiàn)了絲素蛋白作為組織支架材料的可行性。

生物支架材料除了需具備良好的生物相容性和一定的機械強度,可降解性也是一個不可忽視的要素。根據美國藥典對于可吸收(縫線)生物材料的定義,可降解材料在體內60天后應失去大部分強度,故認為蠶絲縫線為不可降解材料[18],但越來越多的研究已經表明,絲素蛋白在體內具有可降解性。Cao等[19]研究發(fā)現(xiàn)絲素蛋白在體內可以降解且降解產物主要是可溶性的肽鏈和游離氨基酸,易于被機體代謝或吸收,對人體無毒性作用及其他不良反應。Wang等[20]通過將三維絲素蛋白支架植入實驗小鼠體內,發(fā)現(xiàn)炎癥相關因子(如TNF-α、INF-γ、IL-6和IL-4等)在mRNA水平表達量很低,幾乎不可測,并且局限于絲素蛋白植入部位,雖然INF-γ的表達量在支架植入體內8周時有短暫的升高,但是在6個月時顯著下降,說明機體對絲素蛋白支架的免疫反應是極其輕微并且局限的,Thurber等[21]的研究結論也與之相符合。于丹丹等[22]利用超聲成像技術評估絲素蛋白在大鼠體內的降解情況,也發(fā)現(xiàn)絲素蛋白凝膠植入Wistar大鼠體內16周后其縱徑、寬徑、橫徑都有統(tǒng)計學意義上的減小,因此也認為絲素蛋白具有可降解性。但是,在組織工程中,理想狀態(tài)下生物材料的降解速率應時刻與組織再生的速率相匹配[23],且可以人為地調控其降解速率,因此材料的可控降解性顯得更為重要。目前研究的絲素蛋白主要來源于家蠶的蠶絲,其降解速率受到以下多種因素的影響,通過對下列因素的研究有望實現(xiàn)對絲素蛋白降解速率的可調控性。

分子結構蠶絲蛋白主要包括包裹在外周的絲膠蛋白和處于核心位置的絲素蛋白,其中絲膠蛋白約占25%,絲素蛋白約占75%,有研究證明絲膠蛋白是引起免疫排斥反應的主要成分。核心的絲素蛋白分子包含一條輕鏈(L鏈)和一條重鏈(H鏈),形成了SILK Ⅰ和SILK Ⅱ兩種構型。SILKⅠ型結構呈曲柄型,主要由無規(guī)則的蜷曲和α螺旋構成,結構不穩(wěn)定,易于分解;而SILK Ⅱ結構更穩(wěn)定,主要由反向平行的β折疊結構組成,是絲素蛋白的基礎構像[24]。絲素蛋白往往同時含有SILK Ⅰ和SILK Ⅱ兩種構型,并且這兩種構型的相對比例對其降解性有較大的影響,SILK Ⅱ所占比例越高,降解性越低。而兩者的比例受到多種因素(如溫度、化學試劑、pH等)的影響。黃訓亭等[25]研究發(fā)現(xiàn),將絲素蛋白多孔膜經過乙醇處理后,SILK Ⅱ結構所占比例升高,降解速率減慢;Hu等[26]發(fā)現(xiàn),當提高絲素蛋白制備過程中水蒸氣退火的溫度(>40 ℃)時,絲素蛋白中SILK Ⅱ結構所占比例也隨之增加,在相同的酶促環(huán)境下降解速率下降。改變冷卻溫度或用碳化二亞胺或乙醇進一步處理絲素蛋白,其β折疊結構增多,降解性下降。增加或減少絲素蛋白中SILK Ⅱ(β折疊)的含量可以改變其降解性。

形態(tài)自然狀態(tài)下的絲素蛋白具有豐富的β-折疊結構,所以降解速率較慢,而經過人工處理的絲素蛋白支架材料包括水凝膠、絲素蛋白膜、多孔的海綿結構等,其結構中β-折疊結構比例減少,所以其更容易被降解。黃訓亭等[25]的研究發(fā)現(xiàn),由于天然蠶絲中絲素蛋白纖維分子鏈結構更為規(guī)整、SILK Ⅱ含量更高,而多孔絲素蛋白纖維膜規(guī)整性較差,因此天然的纖維結構比膜結構的降解速度更慢。若應用絲素蛋白作為組織工程的材料,由于各個組織結構特點的不同,需“因地制宜”選用不同形態(tài)的絲素蛋白支架材料,此時絲素蛋白在不同狀態(tài)下的降解性也應值得關注。

三維孔徑生物支架材料應為細胞提供附著、生長及增殖的場所。支架材料的微觀結構,尤其是其能否最大程度模擬自然狀態(tài)下骨基質的三維結構,對骨髓間充質干細胞等種子細胞的長入、增殖有重要的影響。千建峰等[27]通過觀察不同孔徑絲素蛋白支架在SD大鼠活體內不同時間點的降解,發(fā)現(xiàn)孔徑大小與絲素蛋白材料降解有明顯相關性,且孔徑較大的絲素蛋白支架比孔徑較小的降解速度快,提示可通過改變絲素蛋白支架的孔徑,有效地干預其在生物體內的降解速率以匹配不同組織修復的要求。Wang等[20]也通過研究體內3D支架材料的降解,發(fā)現(xiàn)三維支架孔徑越小,降解速率越低。但組織細胞的長入還與孔徑大小密切相關。在臨床應用絲素蛋白三維多孔支架時,不僅要考慮材料的強度和組織的長入情況,不同孔徑材料的降解性也是一個重要的考慮因素。

絲素蛋白濃度有研究發(fā)現(xiàn)絲素蛋白溶液的濃度越高,所制成的支架材料的降解速率越慢。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn),以六氟異丙醇為溶劑所制得的支架材料與水作為溶劑相比,所得材料中絲素蛋白的濃度較高,降解速率較慢。任何可能影響絲素蛋白溶液濃度的方法或處理都可能會改變材料的降解性,這也為絲素蛋白應用于組織工程領域,對其降解性的控制提供了可行的手段,值得進一步研究。

種植部位絲素蛋白作為骨修復支架材料,植入機體后其降解速率受周圍微環(huán)境的影響較大。植入不同的動物、不同的部位,其生化環(huán)境、機械受力情況、免疫因素、局部的生物化學因素均可以改變降解速率[19],詳細作用機制有待于進一步研究。

酶的降解絲素蛋白可以被多種蛋白酶(如α-胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧化酶等)催化降解成多肽鏈或游離氨基酸。絲素蛋白分為以β折疊為主的結晶區(qū)和以無規(guī)則結構為主的非結晶區(qū),酶催化分解絲素蛋白的過程中會優(yōu)先降解非結晶區(qū)[28]。Numata等[29]研究發(fā)現(xiàn),由于蛋白酶ⅩⅣ能夠作用于結晶區(qū),而α-胰蛋白酶對結晶區(qū)無作用,只能作用于非結晶區(qū),并且隨著非結晶區(qū)的降解破壞,結晶區(qū)(β折疊)所占的比例逐漸增加,故其對絲素蛋白的降解作用明顯小于前者。隨著酶的濃度、作用時間及其與底物接觸面積的增加,降解速率也隨之增加。不同的酶具有不同的作用位點,因此其對絲素蛋白的降解作用也有差異。

γ射線γ射線又稱丙種射線,波長極短、穿透性極高,醫(yī)學領域常用其來殺死腫瘤細胞。金洹宇等[30]研究了不同輻射劑量的γ射線對絲素蛋白降解性的影響,在0～200 kG的照射范圍內絲素蛋白膜的降解性隨受照劑量的增大有所提高。Kojthung等[31]研究發(fā)現(xiàn),隨著γ射線輻射劑量的增加,絲素蛋白結構中SILK Ⅱ結構減少,酶降解速度隨之加快。γ射線能使細胞內的DNA片段斷裂,導致細胞壞死、突變,不能直接用于人體,但該研究為絲素蛋白降解性的間接控制提供了一個新的思路。

磁場Aliramaji等[32]將磁性納米微粒(氧化鐵)通過反向共沉淀法與絲素蛋白/殼聚糖整合制成復合磁性支架材料,在絲素蛋白/殼聚糖支架材料中添加磁性微粒(<2 wt% )后,對外部的磁場有敏感的應答且絲素蛋白/殼聚糖支架自身生物相容性及理化性質并沒有顯著改變,但細胞的吸附、增殖等生物學行為提高,復合材料的降解速率降低。因此,通過施加外部磁場,有望通過非侵入性的方法調節(jié)該復合材料的降解性,但磁性微粒對人體的毒性作用和不良反應、如何調整復合材料中磁性微粒的比重以及外部磁場強度、頻率、持續(xù)時間等問題有待于進一步研究。

結語絲素蛋白作為組織工程領域研究的熱門生物材料之一,其降解性受到多種因素的影響,這些影響因素也是調節(jié)控制絲素蛋白降解速率的重要手段。雖然目前對于絲素蛋白材料可控降解性的臨床研究報道較少,但上述研究都提供了新的方向和思路。