免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)在食品安全檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

蔣 斌 蘇 琰 余先祥 袁 星

（合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 巢湖 238000）

免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)是基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，利用放射性元素、熒光素、酶等標(biāo)記物檢測臨床或其他標(biāo)本。當(dāng)前，免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)與各具特點(diǎn)和用途的定位、定量和超微量測定的標(biāo)記技術(shù)融合發(fā)展，在臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中有著廣泛的應(yīng)用。而免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)近年來在食品檢測中也同樣備受關(guān)注。食品安全問題包括微生物污染、農(nóng)藥級藥物殘留以及生物毒素污染等，具有高效、快速、便捷等優(yōu)點(diǎn)的免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)在食品檢驗(yàn)應(yīng)用方面也有著廣闊的前景。

1 免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)簡介

目前在臨床檢驗(yàn)和食品安全檢驗(yàn)方面，應(yīng)用較為廣泛的免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)包括酶免疫分析技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析、免疫印跡技術(shù)和免疫層析技術(shù)等。

酶免疫分析技術(shù)（Enzyme imrrmnoassay，EIA）是以辣根過氧化物酶等酶標(biāo)記抗原或抗體的作為主要試劑的免疫檢測方法，在抗原與抗體的特異性反應(yīng)完成后，通過酶對底物的催化作用提高反應(yīng)的敏感性。該方法具有安全性較高，價格低廉，以及靈敏度較高等特點(diǎn)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析 （Chemiluminescence imnunoassay，CLIA）則是由Halmann等在20世紀(jì)70年代末建立，通過測定反應(yīng)底物的發(fā)光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)待檢物的定量。免疫印跡試驗(yàn)（immunoblotting test，IBT）是一種將酶免疫分析技術(shù)和凝膠電泳相結(jié)合的的高特異性、敏感性相結(jié)合的檢測技術(shù)[1]。將膠體金作為標(biāo)記物是近年來發(fā)展較快的一種免疫標(biāo)記技術(shù)，其中免疫層析技術(shù)[2]（Immunogold chromatographic assay，ICA）具有簡便、快速、安全、無需特殊的儀器設(shè)備等特點(diǎn)，成為快速診斷領(lǐng)域中的佼佼者。

2 免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)在食品安全檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

2.1 食源性細(xì)菌的免疫學(xué)檢驗(yàn)

細(xì)菌的免疫學(xué)檢驗(yàn)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫層析、熒光免疫檢測等，在這些檢測方法中需要制備具有高特異性、高靈敏度的單克隆抗體以便于得到更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

He等[3]制備了兩種大腸桿菌H7抗原反應(yīng)的兩株單克隆抗體并對其進(jìn)行鑒定。這些單克隆抗體具有O157特異性抗體結(jié)合的潛力，以便于設(shè)計(jì)免疫學(xué)檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確地鑒定食品和臨床標(biāo)本中的大腸桿菌O157:H7。Zhao等[4]利用雜交瘤技術(shù)制備大腸桿菌O157單克隆抗體以及抗血清，建立夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測大腸桿菌O157，并對肉類和巴氏殺菌奶等進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，樣本中大腸桿菌O157的最低檢出率達(dá)到103—104 CFU/mL，該ELISA方法是一種有效的、靈敏的、特異較強(qiáng)的方法。Liu等[5]完成了一種高度特異和敏感的微孔板化學(xué)發(fā)光酶免疫法（CLEIA）的建立和驗(yàn)證，對金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測，并對污水、自來水、河水、幾種食品以及尿和血清等臨床樣本進(jìn)行檢測，最低檢測限達(dá)到0.01 ng/mL。結(jié)果表明，基于高特異性的單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光酶免疫法（CLEIA），在細(xì)菌檢測方面具有較好的應(yīng)用前景。解泉源等[6]建立了一種基于雙抗體夾心反應(yīng)模式的免疫層析方法，該試紙條與其他三十株細(xì)菌無交叉反應(yīng)發(fā)生，僅與金黃色葡萄球菌有微弱交叉反應(yīng)，因此是一種簡便、靈敏的免疫學(xué)檢驗(yàn)方法。Shyu等[7]則設(shè)計(jì)并制備了一種以膠體金為標(biāo)記物的檢測金黃色葡萄球菌的腸毒素B的試紙條，其中在牛奶中檢測限達(dá)到10 ng/mL。

Wang等[8]制備了以鼠傷寒沙門菌的鞭毛蛋白和脂多糖為抗原的單克隆抗體，并建立了ELISA法和膠體金免疫層析方法。Kumar等[9]對比研究了微生物培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）等三種檢測被污染的海產(chǎn)品中沙門氏菌的方法。實(shí)驗(yàn)過程對215份包括魚、蝦、蟹等海產(chǎn)品分別用上述三種方法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，三種方法均能準(zhǔn)確檢測沙門氏菌，且結(jié)果較為一致。

2006年，歐洲地區(qū)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌感染病例高達(dá)1583例，它在歐洲也被列為繼彎曲桿菌、沙門氏菌、耶爾森氏菌和產(chǎn)VT毒素大腸桿菌之后的第五大最常見的人畜共患傳染病感染[10]。Shim等[11]設(shè)計(jì)并開發(fā)了基于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌單克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫層析試紙?jiān)囼?yàn)以及免疫磁珠分離技術(shù)等三種免疫學(xué)檢驗(yàn)方法。并對動物肉類包括牛肉、雞肉、魚肉等樣本進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明：三種方法均能有效、快速地檢測被污染食品中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。

2.2 過敏原的免疫學(xué)檢驗(yàn)

國際食品法典委員會公布了奶類等常見的八類食物含有過敏原食品，認(rèn)為在世界范圍內(nèi)的臨床上90%以上的過敏反應(yīng)（可能也包括了食物不耐受）由其引起。為保護(hù)消費(fèi)者健康，我國《GB/T 23779-2009預(yù)包裝食品中的致敏原成分》均對食品過敏原標(biāo)示有明確要求[12]。

堅(jiān)果類是常見的過敏原之一，Scheibe等[13]開發(fā)了一種免疫印跡技術(shù)，用于檢測巧克力中可能存在的引起過敏的微量榛子和杏仁蛋白成分，最低檢出率達(dá)到5 mg/kg。因此是一種適用于食品生產(chǎn)質(zhì)控的檢驗(yàn)方法。Faeste等[14]采用銪螯合物標(biāo)記抗體的時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）檢測食品中的微量榛子蛋白，這種方法靈敏度高，最低檢出限達(dá)到0.1 mg/kg，對100種隨機(jī)抽樣的標(biāo)注“可能含榛子成分”的挪威零售食品進(jìn)行檢測，其中檢出36種食品中榛子蛋白含量低于0.2 mg/kg，7種食品中榛子蛋白含量高于10 mg/kg。

花生的主要過敏原成分包括Ara hl和Ara h2，可能會引起I型超敏反應(yīng)，患者出現(xiàn)水腫、風(fēng)團(tuán)等癥狀甚至休克死亡。吉坤美等[15]制備了一種以膠體金顆粒為標(biāo)記物的免疫層析試紙條，用該試紙條檢測花生過敏原標(biāo)準(zhǔn)品，檢出率達(dá)到50 ng/mL，并檢測19種外包裝注明含有花生過敏原的食品，檢測結(jié)果均為陽性。

醇溶蛋白廣泛存在于谷物類，是小麥的主要過敏原之一，可能會引發(fā)過敏性哮喘、蕁麻癥和乳糜瀉腸炎等。秦倩茹等[16]建立一種基于雙抗體夾心反應(yīng)模式的ELISA定量檢測方法，是有效檢測過敏原醇溶蛋白的方法，采用鼠抗醇溶蛋白單克隆抗體包被，酶標(biāo)記抗體則采用兔多克隆抗體，實(shí)驗(yàn)表明，檢測限為19.53 ng/mL。

大豆球蛋白是一種存在于大豆中的過敏原，Ma等[17]制備其單克隆抗體并建立了基于競爭法的ELISA方法，檢出限達(dá)到0.3 ng/mL。

β-乳球蛋白是在鮮奶中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一，也是牛奶中的主要過敏原，食品中較低的濃度即可引起超敏反應(yīng)，患者會出現(xiàn)蕁麻疹、過敏性胃腸炎等癥狀。由于嬰兒的消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，因此β-乳球蛋白成為嬰兒時期最常見的過敏原之一。Puerta等[18]建立一種用于檢測食品中微量β-乳球蛋白的酶聯(lián)免疫親和色譜技術(shù)，結(jié)果表明該方法的檢出限20.7 pM。

張?jiān)谲姷萚19]則建立了一種能夠同時檢測花生、蝦、雞蛋蛋清等多種過敏原的Dot-ELISA方法。在NC膜上吸附適當(dāng)濃度的不同過敏原，與待檢小鼠血清中的IgE反應(yīng)結(jié)合，再與生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgE二抗以及親和素偶聯(lián)的HRP反應(yīng)結(jié)合，最后底物顯色，結(jié)果表明，該實(shí)驗(yàn)方法可同時測定多種食品過敏原，是一種快捷、靈敏的免疫學(xué)檢測方法。

2.3 霉菌毒素及其他的免疫學(xué)檢驗(yàn)

目前已知的霉菌毒素有四百多種，最常見的如黃曲霉素等，被霉菌毒素污染的食品或者飼料被誤食后會嚴(yán)重影響健康。為了保障農(nóng)產(chǎn)品安全和質(zhì)量，近年來，各種霉菌毒素檢測技術(shù)不斷被開發(fā)應(yīng)用。樊曉博等[20]制備AFB1的單克隆抗體并利用Eu3+標(biāo)記，設(shè)計(jì)了時間分辨免疫分析技術(shù)檢測花生、稻米等食物中黃曲霉毒素B1。結(jié)果表明，該法靈敏度達(dá)到0.02 μg/L，線性檢測范圍0.01~30 μg/L，特異性較強(qiáng)且檢測效率高。

除了霉菌毒素以外，食品中的重金屬超標(biāo)和農(nóng)藥殘留也對人體健康構(gòu)成巨大威脅，對于這些成分的傳統(tǒng)檢測方法操作不夠簡便，成本較高，因此靈敏度高、操作簡便的免疫分析檢測技術(shù)在不斷開發(fā)。硝基呋喃類藥物是一種能夠殺滅大多數(shù)細(xì)菌、真菌等病原體的廣譜抗生素。然而硝基呋喃類藥物及其代謝物對人體健康有嚴(yán)重的危害，因此被列為違法添加物質(zhì)之一。3-氨基-2-惡唑烷酮（AOZ）是呋喃唑酮在動物組織內(nèi)的代謝物，Cooper等[21]設(shè)計(jì)了檢測AOZ的酶免疫分析方法，并用于檢測對蝦組織中的AOZ。Thongsrisomboon等[22]則建立了一種用于檢測動物飼料中的呋喃唑酮、呋喃西林及呋喃妥因等硝基呋喃類藥物殘留的化學(xué)發(fā)光法?；瘜W(xué)發(fā)光法具有檢測快速、反應(yīng)靈敏、簡單可靠等優(yōu)點(diǎn)，將新方法的檢測結(jié)果與常規(guī)檢測飼料中藥物殘留的高效液相色譜法進(jìn)行比較，兩者結(jié)果一致。

3 展望

民以食為天，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和物質(zhì)生活水平的提高，食品安全問題成為民生問題的焦點(diǎn)之一，也成為公共衛(wèi)生的重要課題之一。成熟的免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)在食品安全檢驗(yàn)中有著重要的地位，然而即使是新興的先進(jìn)的檢驗(yàn)技術(shù)，也存在著一些不足，基因工程的不斷發(fā)展，為檢驗(yàn)工作者提供了新的設(shè)計(jì)思路，例如可以生產(chǎn)具有免疫原性更強(qiáng)的重組抗原替代天然分離出的抗原物質(zhì)，用以擴(kuò)大免疫學(xué)檢驗(yàn)的應(yīng)用范圍，同時也提高檢測的靈敏度和精確度。

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，各類自動化儀器的廣泛應(yīng)用，以及新的標(biāo)記技術(shù)和新材料的開發(fā)應(yīng)用，免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)將得到更加快速的更新和發(fā)展，其在快速檢測領(lǐng)域的應(yīng)用也將更加廣泛。