棘白菌素在念珠菌中的耐藥性

侯欣 徐英春 趙玉沛

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科侵襲性真菌病機制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點實驗室 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院基本外科，北京 100730)

侵襲性真菌病 (invasive fungal disease，IFD)嚴(yán)重威脅著患者的生命，其病死率高，臨床治療效果依賴于患者對抗真菌藥物的應(yīng)答反應(yīng)[1]。但是，抗真菌藥物種類非常有限，唑類藥物通過抑制14-α-羊毛甾醇去甲基化酶使麥角固醇的生物合成減少，后者是細(xì)胞膜的重要組成成分；多烯類 (如兩性霉素B)作為成孔分子與細(xì)胞膜上的麥角固醇結(jié)合；氟胞嘧啶阻礙嘧啶代謝和DNA合成；棘白菌素能夠非競爭性地抑制1,3-β-D-葡聚糖合成酶，該酶為真菌特有酶，不存在于人類及其他哺乳動物體內(nèi)，催化合成真菌細(xì)胞壁重要多糖成分——β-1,3-D-葡聚糖[2]。棘白菌素屬侵襲性念珠菌病 (invasive candidiasis，IC)患者的一線用藥，據(jù)報道在美國60%的念珠菌血癥患者接受棘白菌素治療[3]。隨著棘白菌素使用量的增加，耐藥念珠菌導(dǎo)致臨床治療失敗不斷升高，引起廣泛關(guān)注。

1 念珠菌耐棘白菌素的流行病學(xué)

棘白菌素是脂肽分子，包括阿尼芬凈、卡泊芬凈和米卡芬凈，能夠與FKS基因編碼的β-1,3-D-葡聚糖合成酶的催化亞基結(jié)合，經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)用于治療食道念珠菌病和念珠菌血癥，并作為中性粒細(xì)胞減少癥發(fā)熱患者經(jīng)驗治療和造血干細(xì)胞移植患者的預(yù)防用藥[4]。2016年美國感染性疾病學(xué)會 (Infectious Diseases Society of America，IDSA)推薦中性粒細(xì)胞減少念珠菌血癥患者初始治療使用棘白菌素，對非中性粒細(xì)胞減少的非危重患者，靜脈或口服氟康唑是可替代棘白菌素的初始治療藥物，對于感染唑類耐藥念珠菌和危重患者仍推薦使用棘白菌素[5]。棘白菌素抗菌譜較廣，對大多數(shù)念珠菌有效，體外有殺菌效應(yīng)，對曲霉屬則為抑菌活性，對隱球菌屬、鐮刀菌屬、毛孢子菌屬、接合菌屬無效[6]。對于唑類耐藥菌株，如克柔念珠菌、光滑念珠菌，以及念珠菌生物膜有效。其口服生物利用度低，均需靜脈注射；組織分布好，但難以進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)和眼睛。與其他藥物相互作用少，相關(guān)不良反應(yīng)也較少[7]。

近年來，念珠菌對棘白菌素的耐藥率不斷升高，特別是光滑念珠菌，可能與棘白菌素的預(yù)防用藥有關(guān)。多數(shù)棘白菌素耐藥是長期治療引起，但也有短期用藥導(dǎo)致耐藥的報道[8]。針對念珠菌血癥的全球抗菌藥物監(jiān)測項目SENTRY研究結(jié)果顯示，8.0%～9.3%的光滑念珠菌對棘白菌素耐藥[9]。據(jù)美國一家醫(yī)院報道，十年間 (2001～2010)光滑念珠菌對棘白菌素的耐藥率從4.9%增至12.3%，且80%耐藥菌感染臨床治療失敗[10]。更重要的是光滑念珠菌天然對唑類藥物的敏感性低，已出現(xiàn)多重耐藥菌株，給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)。我國大規(guī)模多中心侵襲性真菌監(jiān)測網(wǎng) (CHIF-NET)2010～2014年數(shù)據(jù)顯示，光滑念珠菌對棘白菌素的耐藥率低于1%[11]。CHIF-NET 2010～2012年數(shù)據(jù)顯示，近平滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌對棘白菌素的敏感性高于99.5%[12]。李岷等[13]利用微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法檢測棘白菌素對氟康唑耐藥的念珠菌的體外敏感性，結(jié)果表明三種棘白菌素對氟康唑耐藥的念珠菌均有較好的抗菌活性,提示該類藥物可在臨床上治療氟康唑耐藥的念珠菌感染。

2 念珠菌耐棘白菌素的檢測方法和判定標(biāo)準(zhǔn)

棘白菌素耐藥性檢測包括微量肉湯稀釋法、E-test、紙片擴散法、半自動化檢測系統(tǒng)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS)、分子方法檢測FKS基因突變。

2.1 表型檢測

美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會 (CLSI)和歐洲臨床微生物及感染病學(xué)會 (EUCAST)均建立了標(biāo)準(zhǔn)的微量肉湯稀釋法檢測棘白菌素敏感性，這些方法已通過參考實驗室證實其結(jié)果可靠。而且CLSI紙片法也可用于檢測其敏感性。根據(jù)CLSI和EUCAST折點文件及最新文獻報道[14]的流行病學(xué)折點 (ECV)對常見念珠菌棘白菌素藥敏折點進行了匯總 (見表1)。由于實驗室間卡泊芬凈藥敏結(jié)果差異較大，因此EUCAST未建立卡泊芬凈的折點并且不建議使用卡泊芬凈的MIC值進行臨床評估。表中可見，近平滑念珠菌和季也蒙念珠菌的MIC明顯高于其他念珠菌。

一些實驗室在使用CLSI、E-test和Sensititre Yeast One進行藥敏時發(fā)現(xiàn)20%的光滑念珠菌和1/3以上的克柔念珠菌對阿尼芬凈敏感而對卡泊芬凈不敏感[15-16]，可能與卡泊芬凈體外檢測的可變性有關(guān)。因此，EUCAST推薦阿尼芬凈和米卡芬凈作為卡泊芬凈藥敏的標(biāo)志物。在一項多中心研究中，商品化顯色微量肉湯稀釋法Sensititre Yeast One表現(xiàn)出良好的實驗室間結(jié)果一致性[16]。VITEK 2能夠檢測卡泊芬凈的敏感性，但目前該系統(tǒng)不能區(qū)分光滑念珠菌中介和敏感，因為折點不包括在其藥物濃度范圍，所以限制了它的應(yīng)用。

2.2 基因檢測

FKS突變與棘白菌素耐藥息息相關(guān)，因此可通過FKS基因測序檢測棘白菌素的敏感性。由于不同菌種所用的FKS引物不同，因此需要準(zhǔn)確鑒定菌種，且該方法價格昂貴。目前尚無商品化的試劑盒，需要具備一定的分子生物學(xué)專業(yè)知識并通過內(nèi)部驗證。

2.3 MALDI-TOF MS

目前，將念珠菌和曲霉菌暴露于一系列卡泊芬凈濃度中孵育15 h，MALDI-TOF MS通過檢測真菌蛋白質(zhì)組的變化從而判斷藥物敏感性，而且與CLSI標(biāo)準(zhǔn)方法的一致率為94.1%[17]。將白念珠菌與0.03 μg/mL和32 μg/mL的卡泊芬凈孵育3 h，利用MALDI-TOF真菌藥敏試驗檢測模式快速檢測敏感性[18]，結(jié)果與FKS1突變及參考方法一致。MALDI-TOF可能成為快速可靠檢測棘白菌素敏感性的方法，需要擴大菌種和藥物類型進行進一步研究。

表1 常見念珠菌對棘白菌素藥物敏感性測定CLSI折點、EUCAST折點和流行病學(xué)折點比較

注：S.敏感，I.中介，R.耐藥，WT.野生型，non-WT.非野生型；a.流行病學(xué)折點和紙片法折點根據(jù)最新文獻整理[14]

3 念珠菌耐棘白菌素的機制

3.1 FKS突變

念珠菌對棘白菌素耐藥的主要原因是編碼1,3-β-D-葡聚糖合成酶的基因FKS1或FKS2發(fā)生突變，導(dǎo)致對該類藥物的親和力降低。白念珠菌的基因突變主要發(fā)生在FKS1的兩個熱點區(qū) (hot spot regions，HS)氨基酸殘基641至649 (HS1)和殘基1345至1365 (HS2)之間[19]。近平滑念珠菌復(fù)合體和季也蒙念珠菌對棘白菌素的MIC較高，因為前者FKS1 HS1的第660個氨基酸殘基由丙氨酸代替了脯氨酸，后者第633個氨基酸殘基由蛋氨酸代替了亮氨酸和第634個丙氨酸代替了蘇氨酸[20]。本文將已報道的天然棘白菌素敏感低的菌種與其固有FKS突變進行了總結(jié) (見表2)。天然棘白菌素低敏感性對臨床治療的影響不明，雖然這些氨基酸的改變在一定程度上降低了葡聚糖合成酶對棘白菌素的敏感性，但也受治療水平的影響，因此合適劑量的棘白菌素對近平滑念珠菌復(fù)合體引起的感染仍然有效，但與患者人群有關(guān)[21-22]。研究表明近平滑念珠菌葡聚糖合成酶活性比白念珠菌低10至50倍，或許與其高MIC值有關(guān)[20]。光滑念珠菌的基因突變則發(fā)生在FKS1或FKS2，其中FKS2突變的氨基酸殘基在659至667 (HS1)和1374至1381 (HS2)之間[23]，F(xiàn)KS2氨基酸突變發(fā)生率高于FKS1[4，23]。光滑念珠菌FKS1或FKS2的無義突變也能引起明顯耐藥[23]。FKS突變是棘白菌素光滑念珠菌感染治療失敗的獨立危險因素，而且在預(yù)測臨床治療效果上，尤其當(dāng)使用卡泊芬凈治療時，F(xiàn)KS突變比高MIC更有優(yōu)勢[24]。

表2 天然棘白菌素低敏感性菌種FKS突變位點

3.2 藥物耐受性

棘白菌素能夠減少細(xì)胞壁重要成分β-1,3-D-葡聚糖的合成，導(dǎo)致顯著的細(xì)胞壓力從而誘導(dǎo)細(xì)胞多種適應(yīng)性保護機制。體外小鼠藥效動力學(xué)實驗表明這些適應(yīng)性應(yīng)答使得一部分細(xì)胞能夠持續(xù)耐受高濃度棘白菌素[30]。細(xì)胞壁壓力感受器 (如Mtl2、Wsc1)促發(fā)壓力適應(yīng)通路，包括細(xì)胞壁完整性、蛋白激酶C (PKC)、鈣調(diào)磷酸酶-Crz1、高滲性甘油 (HOG)。Hsp90也是重要的壓力應(yīng)答成分，通過鈣調(diào)磷酸酶和效應(yīng)器Crz1發(fā)揮作用。破壞Hsp90能夠降低白念珠菌和光滑念珠菌的藥物耐受性[31-32]。

另一個重要的促進藥物耐受性的原因是細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的合成增加。幾丁質(zhì)和葡聚糖是細(xì)胞壁主要的結(jié)構(gòu)成分，且其生物合成是相互依賴的。幾丁質(zhì)的補償性增長受PKC、鈣調(diào)磷酸酶和HOG的調(diào)節(jié)。在動物實驗中已證實細(xì)胞壁幾丁質(zhì)增加的突變株對棘白菌素耐藥，細(xì)胞壁成分改變能夠使細(xì)胞壁厚度發(fā)生變化并通過增強免疫識別引起顯著的宿主應(yīng)答。幾丁質(zhì)生物合成的增加與高藥物濃度下的“矛盾生長”也有關(guān)[33-34]。在最近一項對卡泊芬凈低敏感而對米卡芬凈高敏感的光滑念珠菌研究中，藥物存在時能夠調(diào)節(jié)鞘脂類的生物合成，這與棘白菌素脂肪族尾與細(xì)胞膜鞘脂相互作用有關(guān)[35]。

藥物耐受性通路不足以導(dǎo)致臨床治療失敗，主要是使細(xì)胞在藥物存在的情況下保持穩(wěn)定，從而形成穩(wěn)定的FKS突變而成為耐藥菌，其潛在的遺傳機制尚不明確，可能與DNA修復(fù)有關(guān)。已證實的白念珠菌和光滑念珠菌的基因組在唑類藥物中具有可塑性，可能同樣適應(yīng)于棘白菌素。

3.3 生物膜

同細(xì)菌一樣，真菌生物膜也是細(xì)胞嵌入大量多糖基質(zhì)，念珠菌和曲霉菌的胞外生物膜基質(zhì)主要由β葡聚糖組成，能夠隔絕藥物，降低藥物在細(xì)胞膜上的濃度。通過化學(xué)或基因方法調(diào)節(jié)胞外葡聚糖的合成，能夠提高細(xì)胞對抗真菌藥物的敏感性。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Rlm和Smi1及調(diào)節(jié)葡聚糖合成的FKS基因均可導(dǎo)致耐藥生物膜[36]。

4 結(jié) 語

棘白菌素耐藥率在不斷升高，特別是長期接受治療的危重患者更易出現(xiàn)，限制了藥物的選擇，患者預(yù)后往往不佳，因此早期藥敏檢測十分重要。大型醫(yī)院對于高?；颊邞?yīng)進行藥敏試驗，過去幾年藥物敏感性檢測方法已得到優(yōu)化，商品化的檢測方法有待于進一步完善，分子基因檢測和MALDI-TOF是對常規(guī)檢測很好的補充。合理有效的抗真菌藥物管理能夠減少不必要的藥物使用，降低選擇性壓力導(dǎo)致的耐藥，減緩耐藥率的升高。

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