RGD肽修飾PEEK表面及其與成骨細(xì)胞的相容性

鄭延延，劉呂花，董 軍

(川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000)

0 前言

特種工程塑料PEEK由于其彈性模量(3～4 GPa)接近人體皮質(zhì)骨的彈性模量(6～23 GPa)，可有效避免傳統(tǒng)醫(yī)用金屬材料彈性模量過(guò)高造成的“應(yīng)力屏蔽”效應(yīng)，有望替代傳統(tǒng)醫(yī)用金屬材料用作骨科植入體[1-3]。但PEEK本身不具備生物活性，其表面不利于成骨細(xì)胞的黏附，植入體內(nèi)后其不能與宿主骨形成良好的骨整合，這在一定程度上限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。植入體通過(guò)其表面與骨組織接觸，構(gòu)建有利的表面物理化學(xué)性質(zhì)，有望改善骨細(xì)胞在PEEK表面的黏附與生長(zhǎng)，促進(jìn)其與骨組織之間的骨整合。目前，研究者一方面利用等離子噴涂等[4-5]方法在PEEK表面制備具有生物活性的羥基磷灰石涂層來(lái)改善PEEK的生物活性；另一方面，采用等離子體處理等[6-7]手段直接改性PEEK基體表面，此方法在改善PEEK表面生物活性的同時(shí)也可避免因生物活性涂層與基體結(jié)合力差、易脫落引起炎癥等問(wèn)題。由于PEEK固有的化學(xué)惰性，使得通過(guò)一般的化學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行改性極其困難。盡管研究者們進(jìn)行了一些探索性工作，如利用濃硫酸處理PEEK表面構(gòu)建3D多孔網(wǎng)絡(luò)[8]，硅烷化處理PEEK表面引入—COOH、氨基、磷酸基[9-10]，重氮化學(xué)在PEEK表面引入磷酸基[11]等，但這些方法的處理程序均較為復(fù)雜。等離子體處理不僅可以在各種基質(zhì)包括非反應(yīng)性材料如PEEK表面引入各種化學(xué)基團(tuán)，而且同時(shí)不會(huì)改變材料的本體性質(zhì)，包括力學(xué)性質(zhì)[12]；此外，其處理過(guò)程較為簡(jiǎn)單，而且已有研究利用氧氣[13]、氨氣[14]等離子體處理PEEK表面來(lái)改善其生物活性。精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成的RGD序列是許多黏附蛋白所共有的細(xì)胞間識(shí)別的最小序列，其在介導(dǎo)細(xì)胞黏附、遷移、生長(zhǎng)等方面起著重要作用[15]。因此，本文首先采用丙烯酸等離子體處理PEEK表面，在其表面引入—COOH基團(tuán)，進(jìn)而利用此—COOH基團(tuán)將RGD肽鍵合在PEEK表面，以期改善PEEK材料的生物活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料

PEEK圓片， 450G，直徑為15 mm，江蘇君華特種工程塑料制品有限公司；

丙烯酸，分析純，美國(guó)Sigma-aldrich公司;

噻唑藍(lán)(MTT)，純度為98 %，美國(guó)Sigma-aldrich公司；

RGD，純度99.5 %，吉爾生化有限公司；

1 - (3 - 二甲氨基丙基) - 3 - 乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，純度為99 %，成都貝斯特試劑有限公司；

N - 羥基琥珀酰亞胺(NHS)，分析純，純度為99 %，成都貝斯特試劑有限公司；

2 - (N - 嗎啉)乙磺酸(MES)，分析純，純度為98 %，成都貝斯特試劑有限公司；

成骨細(xì)胞，MC3T3-E1，四川大學(xué)華西口腔疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

最低必需培養(yǎng)基(α-MEM)、磷酸鹽緩沖劑(PBS)，美國(guó)Hyclone公司。

1.2 主要設(shè)備及儀器

低溫等離子體處理儀，DT-04，蘇州市奧普斯等離子體科技有限公司；

等離子體接枝汽化儀，DJ-01，蘇州市奧普斯等離子體科技有限公司；

X射線光電子能譜儀(XPS)，XSAM800，英國(guó)Kratos有限公司；

水接觸角測(cè)量?jī)x，DSA100，德國(guó)克魯士公司；

表面輪廓儀，Perthometer M1，德國(guó)Mahr公司；

萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)，SANS-CMT4503， 深圳SANS 公司；

掃描電子顯微鏡(SEM)，JSM-6300，日本Hitachi公司；

酶標(biāo)儀，Varioskan Flash3001，美國(guó)Thermo公司。

1.3 樣品制備

PEEK表面的丙烯酸等離子體處理：丙烯酸等離子體處理PEEK表面之前，先用氬氣(Ar)等離子體處理PEEK表面以改善PEEK基體與聚丙烯酸涂層之間的黏附強(qiáng)度；輝光放電之前的背底真空度為8 Pa，等離子體處理的工作溫度為20 ℃；Ar等離子體處理時(shí)的真空度為32 Pa，等離子體處理的功率為300 W，處理時(shí)間為3 min；Ar等離子體處理后的真空度維持在7 Pa，并引入丙烯酸氣體(采用等離子體接枝汽化儀將丙烯酸蒸汽引入反應(yīng)腔)，保持反應(yīng)腔真空度為19 Pa，50 W功率下丙烯酸等離子體處理PEEK表面3 min(圖1)，待等離子體反應(yīng)腔的壓力恢復(fù)到大氣壓后，移出樣品，將丙烯酸等離子體處理的PEEK樣品標(biāo)記為PEEK-COOH，未處理的PEEK標(biāo)記為P-PEEK；

PEEK的表面化學(xué)鍵合RGD肽：將PEEK-COOH試樣首先沒(méi)入含EDC和NHS(摩爾比2∶5)的0.1 mol/L MES(pH=6)緩沖溶液中，室溫反應(yīng)2 h后，用0.1 mol/L MES沖洗，再將樣品轉(zhuǎn)入10 mL含有1 mg RGD的PBS(pH=7.4)中，室溫反應(yīng)2 h(圖1)；反應(yīng)后的試樣用PBS沖洗后，依次用4 mol/L尿素、1 mol/L氯化鈉各超聲清洗10 min，以去除PEEK表面物理吸附的RGD，再用大量去離子水清洗，放入干燥器中干燥；將表面鍵合有RGD的試樣標(biāo)記為PEEK-RGD。

圖1 等離子體處理PEEK表面和化學(xué)鍵合RGD肽的過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic illustration of plasma treated PEEK surface and chemical bonded RGD peptide on PEEK surface

1.4 性能測(cè)試與結(jié)構(gòu)表征

XPS測(cè)試：激發(fā)源為Al Kα，起飛角為20 °，以沾污碳C1s=284.8 eV為能量參考；

水接觸角測(cè)試：用注射器將3 μL的蒸餾水垂直懸滴到樣品表面，使用接觸角測(cè)量?jī)x自帶成像系統(tǒng)拍攝液滴照片并分析水接觸角的大小，每個(gè)樣品測(cè)定3個(gè)不同的區(qū)域，取平均值；

平均粗糙度(Ra)的測(cè)定：使用表面輪廓儀對(duì)PEEK表面的粗糙度進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試樣品的3個(gè)不同區(qū)域，取平均值；

拉伸強(qiáng)度按 GB/T 16421—1996 測(cè)試，拉伸速率為5 mm/min；

彎曲強(qiáng)度按 GB/T 16419—1996 測(cè)試，試驗(yàn)速率為1 mm/min；

體外細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)：采用小鼠的成骨細(xì)胞MC3T3-E1評(píng)價(jià)細(xì)胞在材料表面的黏附、鋪展行為及增殖活性，其具體操作為：在滅菌后的P-PEEK、PEEK-COOH和PEEK-RGD試樣表面，以3種細(xì)胞濃度(1.0×105、2.0×104、2.5×104個(gè)/孔)進(jìn)行接種；在24孔板中培養(yǎng)4 h后，取1.0×105個(gè)/孔細(xì)胞濃度的PEEK樣品用PBS沖洗以去除表面未黏附的細(xì)胞，用含MTT的α-MEM培養(yǎng)液檢測(cè)細(xì)胞的黏附情況，酶標(biāo)儀上選擇490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值；取2.0×104個(gè)/孔細(xì)胞濃度的PEEK樣品依次用PBS沖洗，4 %戊二醛固定，梯度乙醇(10 %、30 %、50 %、70 %、80 %、95 %、100 %)脫水，干燥后噴金，再用SEM觀察細(xì)胞在材料表面的鋪展情況；2.5×104個(gè)/孔細(xì)胞濃度的PEEK樣品，分別在培養(yǎng)1、4、7 d后，用含MTT的α-MEM培養(yǎng)液檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，酶標(biāo)儀上選擇490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEEK表面經(jīng)丙烯酸等離子體處理的分析

由圖2可知，比較P-PEEK和PEEK-COOH的XPS全譜圖發(fā)現(xiàn)，譜圖中沒(méi)有出現(xiàn)新峰，說(shuō)明丙烯酸等離子體處理前后，PEEK表面的元素種類沒(méi)有發(fā)生變化。但從P-PEEK和PEEK-COOH表面的高分辨C1s譜圖(圖3)來(lái)看，PEEK-COOH樣品的C1s譜圖在289.0 eV處出現(xiàn)了一個(gè)新的擬合峰，是典型的—COOH位置，和文獻(xiàn)[16]、[17]報(bào)道的結(jié)果一致。這說(shuō)明PEEK表面的化學(xué)環(huán)境發(fā)生了顯著的變化，采用丙烯酸等離子體處理成功地將—COOH引入至PEEK表面。由接觸角和粗糙度測(cè)量結(jié)果(圖4)可知，PEEK表面經(jīng)丙烯酸等離子體處理后，顯著改善了其表面的親水性和粗糙度，其表面的水接觸角值顯著(*P<0.05)降低，Ra顯著(*P<0.05)增加。

1—P-PEEK 2—PEEK-COOH 3—PEEK-RGD圖2 P-PEEK，PEEK-COOH和PEEK-RGD的XPS全譜圖Fig.2 XPS wide spectra of P-PEEK,PEEK-COOH and PEEK-RGD

1—C—C/C—H 2—C—O 3—CO 4—COOH 5—C—O、C—N 6—CO、OC—NH 7—COOH、NH—C(NH)—NH2(a)P-PEEK (b)PEEK-COOH (c)PEEK-RGD圖3 P-PEEK、PEEK-COOH和PEEK-RGD的高分辨C1s譜圖Fig.3 C1s high-resolution XPS spectra of P-PEEK, PEEK-COOH and PEEK-RGD

注：*P<0.05，P-PEEK與PEEK-COOH和PEEK-RGD比較；圖4 P-PEEK、PEEK-COOH和PEEK-RGD表面的水接觸角和Ra值Fig.4 Water contact angle and roughness Ra of P-PEEK,PEEK-COOH and PEEK-RGD surface

2.2 PEEK表面經(jīng)化學(xué)鍵合RGD肽的分析

1—NH—CO 2—NH—C(NH)—NH2圖5 PEEK-RGD的高分辨N1s譜圖Fig.5 N1s high-resolution XPS spectra of PEEK-RGD

PEEK-RGD的XPS全譜圖(圖2)中出現(xiàn)了RGD肽的特征N1s峰，說(shuō)明RGD肽被成功引入至PEEK的表面。PEEK-RGD的高分辨N1s譜圖在400.1、401.7 eV處出現(xiàn)了2個(gè)擬合峰(圖5)，分別對(duì)應(yīng)于酰胺鍵中的氮和胍基中的氮[18]。PEEK-RGD的高分辨N1s譜圖中，在399.0～399.6 eV處沒(méi)有擬合出RGD肽中的—NH2特征峰[19]，說(shuō)明RGD肽中的—NH2基本上完全和PEEK-COOH表面的—COOH發(fā)生了反應(yīng)。

從圖3的C1s譜圖中可以看出，PEEK-COOH和PEEK-RGD在287.2 eV處均有1個(gè)擬合峰，但PEEK-RGD在該處的擬合峰面積明顯比PEEK-COOH的大(表1)，這是由于RGD鍵合在PEEK的表面后，酰胺鍵中的碳也貢獻(xiàn)于此處[20]。和PEEK-COOH相比，PEEK-RGD的C1s譜圖中286.0 eV處擬合峰的相對(duì)面積增大，其歸因于RGD鍵合在PEEK的表面后引入的C—N鍵；289.4 eV處擬合峰的相對(duì)面積增大，其歸因于RGD鍵合在PEEK的表面后引入的羧基碳和胍基碳(表1)。PEEK表面固定RGD后，其表面的接觸角發(fā)生了輕微的降低，Ra稍有增加(圖4)。

表1 P-PEEK、PEEK-COOH和PEEK-RGD的表面碳各成鍵的相對(duì)含量Tab.1 Relative composition of different C-species forP-PEEK, PEEK-COOH and PEEK-RGD

2.3 表面處理對(duì)PEEK力學(xué)性能的影響

圖6 PEEK表面改性前后的拉伸強(qiáng)度及彎曲強(qiáng)度Fig.6 Tensile strength and flexural strength of PEEKbefore and after surface treatment

采用靜態(tài)力學(xué)分析評(píng)價(jià)了丙烯酸等離子體處理和RGD肽修飾對(duì)PEEK力學(xué)性能的影響，其結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，PEEK-COOH和PEEK-RGD相對(duì)于P-PEEK，其拉伸強(qiáng)度和彎曲強(qiáng)度均未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明等離子體處理和RGD肽的修飾均未影響PEEK優(yōu)異的力學(xué)性能。

2.4 體外成骨細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)

樣品，培養(yǎng)時(shí)間：(a)P-PEEK，4 h (b)PEEK-COOH，4 h (c)PEEK-RGD，4 h(d)P-PEEK，1 d (e)PEEK-COOH，1 d (f)PEEK-RGD，1 d圖8 成骨細(xì)胞在PEEK樣品表面培養(yǎng)4 h和1 d的SEM照片F(xiàn)ig.8 SEM of MC3T3-E1 cells on PEEK surface after culturing for 4 h and 1 d

注：*P<0.05，PEEK-RGD與P-PEEK和PEEK-COOH比較圖7 MTT法測(cè)定成骨細(xì)胞在P-PEEK、PEEK-COOH和PEEK-RGD表面的黏附情況Fig.7 Adhesion of MC3T3-E1 cells on P-PEEK, PEEK-COOH and PEEK-RGD surface measured by MTT assay

從圖7可以看出，PEEK-RGD試樣組的吸光度值最高，說(shuō)明RGD顯著(*P<0.05)改善了PEEK表面成骨細(xì)胞的黏附能力；PEEK-COOH試樣組的吸光度值高于P-PEEK試樣組，說(shuō)明—COOH功能化的表面也有利于成骨細(xì)胞的黏附。從成骨細(xì)胞MC3T3-E1在PEEK材料表面的黏附鋪展形貌圖(圖8)可以看出，培養(yǎng)4 h時(shí)，P-PEEK試樣表面的成骨細(xì)胞大多呈球形，而PEEK-COOH和PEEK-RGD試樣表面的細(xì)胞大多數(shù)呈伸展?fàn)睿襊EEK-RGD試樣表面的細(xì)胞有較多較長(zhǎng)的絲狀偽足；培養(yǎng)1 d時(shí)，P-PEEK試樣表面只有部分細(xì)胞呈伸展?fàn)?，而PEEK-COOH和PEEK-RGD試樣表面的成骨細(xì)胞均表現(xiàn)出更好的鋪展形貌，且培養(yǎng)1 d時(shí)PEEK-RGD試樣表面的成骨細(xì)胞緊貼著其表面生長(zhǎng)并鋪滿了整個(gè)材料表面，說(shuō)明PEEK-RGD試樣表面具有較好的成骨細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。

由圖9可以看出，成骨細(xì)胞MC3T3-E1在試樣表面的增殖呈現(xiàn)時(shí)間的依賴性，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)目明顯增加。成骨細(xì)胞MC3T3-E1在PEEK-RGD和PEEK-COOH試樣表面的增殖活性高于P-PEEK試樣，且培養(yǎng)4 d和7 d時(shí)，PEEK-RGD試樣表面的成骨細(xì)胞數(shù)量顯著(*P<0.05)高于PEEK-COOH試樣組，說(shuō)明相對(duì)于—COOH功能化的PEEK表面，鍵合有RGD的PEEK表面更有利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。綜上可知，表面鍵合有RGD的PEEK材料更有利于成骨細(xì)胞的鋪展與增殖。

注：*P<0.05，PEEK-RGD與P-PEEK和PEEK-COOH比較圖9 MTT法測(cè)定成骨細(xì)胞在P-PEEK、PEEK-COOH和PEEK-RGD表面的增殖情況Fig.9 Proliferation of MC3T3-E1 cells on P-PEEK, PEEK-COOH and PEEK-RGD surface measured by MTT assay

已有研究結(jié)果表明，生物材料的表面潤(rùn)濕性、表面化學(xué)和表面粗糙度等因素決定著細(xì)胞與材料之間的相互作用[21]。一般來(lái)說(shuō)，與疏水性表面相比，親水性表面更有利于成骨細(xì)胞的黏附與生長(zhǎng)，粗糙表面比光滑表面表現(xiàn)出更好的骨整合性。PEEK-COOH和PEEK-RGD的水接觸角和Ra均相近(圖4)，因此其表面較好的細(xì)胞相容性應(yīng)歸因于其表面不同的化學(xué)性質(zhì)。細(xì)胞鋪展是細(xì)胞開(kāi)始指數(shù)增長(zhǎng)前黏附過(guò)程中的一個(gè)必須階段，而且細(xì)胞鋪展對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖與分化有著顯著的影響，而材料的表面化學(xué)性質(zhì)在很大程度上影響著細(xì)胞鋪展[22]。培養(yǎng)4 h的PEEK-COOH和PEEK-RGD表面的成骨細(xì)胞呈扁平的形貌，并且成骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)擴(kuò)展到整個(gè)材料表面，這有利于后續(xù)成骨細(xì)胞保持較高的增殖活性。骨科植入體表面改善的成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞前體細(xì)胞黏附，有利于改善骨與植入體之間的骨整合和植入體長(zhǎng)期的穩(wěn)定。本文發(fā)現(xiàn)鍵合有RGD的PEEK表面表現(xiàn)出很好的成骨細(xì)胞黏附與增殖，且成骨細(xì)胞緊貼其表面生長(zhǎng)。因此，RGD修飾的PEEK植入體植入人體后，其周?chē)鷳?yīng)有更多新骨生成，與骨組織表現(xiàn)出更好的骨整合性。

3 結(jié)論

(1)丙烯酸等離子體處理可在PEEK表面引入—COOH基團(tuán)，并通過(guò)—COOH基團(tuán)可將RGD肽化學(xué)鍵合在PEEK表面；

(2)丙烯酸等離子體處理和RGD肽修飾對(duì)PEEK優(yōu)異的力學(xué)性能無(wú)影響；

(3)體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于P-PEEK和PEEK-COOH的表面， PEEK-RGD表面更有利于成骨細(xì)胞的黏附與增殖；且成骨細(xì)胞緊貼著PEEK-RGD的表面生長(zhǎng)，有利于PEEK-RGD植入體與骨組織形成牢固的骨整合。

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