建甌白筍及其竹葉蛋白雙向電泳分析

楊金來，吳良如，潘雁紅,楊慧敏，鐘 浩, 修誠明

(1.國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心，浙江 杭州 310012； 2.浙江省竹子高效加工重點實驗室，浙江 杭州 310012；3.福建6·18協(xié)同創(chuàng)新院竹產業(yè)(建甌)分院，福建 建甌 353100)

中國現(xiàn)有竹林面積 601 萬hm2，以毛竹林為主(約占2/3)[1]，主要生長于福建、浙江、江西、湖南等省份[2]。毛竹林主要生產竹筍、竹葉和竹材等產品，其中竹筍和竹葉[3]富含蛋白，是一種潛在的天然可再生的綠色植物蛋白源。新鮮竹筍含水量約為90%，其蛋白含量高為1.49%～4.04%，平均值為2.65%，干物質蛋白含量非常豐富[4-5]。徐圣友等[6]分析了不同品種竹筍的蛋白質，其干物質含量為19.01%～30.66%，其中安徽皖南毛竹為19.01%。劉永等[7]提取了肇慶竹葉中的蛋白，其提取率為9.86%。因此，研究竹筍和竹葉蛋白情況對于其進一步高值化利用具有一定的指導意義。杭州余杭地區(qū)，其毛竹筍[8]共含有1 014個蛋白點，等電點主要集中在pH=6～7，相對分子質量主要集中在45～116 kDa；雷竹筍[9]僅含有812個蛋白點數，等電點集中于pH=9～10，相對分子質量集中于45～116 kDa。

竹筍好吃，但生吃有麻感，而建甌市毛竹筍就可以生吃，因筍肉顏色比一般的毛竹筍肉白，當地人俗稱白筍。建甌市具有獨特的氣候環(huán)境和良好的土質，其毛竹粗大，生長出來的竹筍肉質鮮嫩、通體潔白、口感脆甜。因此，非常有必要進一步研究建甌白筍的蛋白情況。研究以建甌白筍及其竹葉(圖1)為原料提取出總蛋白，并進行了總蛋白的雙向電泳實驗。

圖1 建甌白筍及其竹葉Fig.1 Jianou Bai Moso bamboo shoots and leaves

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

主要材料：建甌白筍和竹葉(同1棵竹子)采自福建省建甌市房道鎮(zhèn)連地村；5 mg·mL-1牛血清(BSA)標準品(Sigma)；二硫蘇糖醇(DTT)、溴酚藍、丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、過硫酸銨、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、正丁醇、碘乙酰胺(IAA)、低熔點瓊脂糖、普通瓊脂糖、乙醇、冰醋酸、硫代硫酸鈉、硝酸銀、碳酸鈉、甲醛、Na2EDTA·H2O等均為AR；Bradford 染液(595 nm)、Tris 飽和酚、RB 裂解液、PMSF(p0754)、蛋白提取緩沖液(500 mmol·L-1Tris-HCl，pH=8.65；50 mmol·L-1EDTA；100 mmol·L-1KCl；2 mmol·L-1DTT)等由上海生工提供；干膠條(24 cm，pH 3～10，GE)，IPG Buffer pH 3～10 (GE)，2D電泳樣品提取緩沖液系列(上海生工，PL039)、2D Equilibration Buffer(上海生，SD6030)。

主要儀器：UV1800型分光光度儀(上海美譜達儀器有限公司)，等電聚焦儀(GE ETTAN IPGPHOR3)，DALT-SIX SDS-PAG電泳儀(GE Healthcare)，掃描儀(MICROTEK ScanMaker i800)等。

1.2 方法

1.2.1總蛋白提取與純化 取1.5 g建甌白筍(竹葉)充分液氮研磨后，轉移到50 mL離心管，加入10 mL蛋白提取緩沖液，再加10 mL Tris飽和酚，充分振蕩后于冰上保溫，每隔5 min振蕩1次，總共4次。然后4 ℃離心20 min(6 000 r·min-1)，將上層酚相轉移至15 mL離心管中。在離心管中加入與酚相同體積的蛋白提取緩沖液，充分振蕩后于冰上保溫，每隔5 min振蕩1次，總共6次，4℃離心30 min(5 000 r·min-1)，將上層酚相轉移至15 mL離心管中。加入5倍酚體積的醋酸銨甲醇溶液對蛋白進行沉淀，充分振蕩后置于冰上保溫，每隔5 min振蕩1次，總共6次，-20 ℃沉淀過夜。蛋白質離心30 min(4 ℃，5 000 r·min-1)，除去上清液，加入5 mL甲醇對蛋白進行洗滌，除去蛋白中的色素及鹽，離心30 min (4 ℃，5 000 r·min-1)，再加入5 mL、4 mL丙酮對蛋白洗滌2次，離心20 min(4 ℃，12 000 r·min-1)后，溶解備用(竹筍蛋白3.0 mL，竹葉蛋白8.0 mL)。

1.2.2蛋白定量 以牛血清蛋白(BSA)為標準蛋白，采用Bradford法[10]測定建甌白筍及其竹葉蛋白濃度并定量，用于雙向電泳實驗。

1.2.3雙向電泳 量取一定體積的竹筍及其竹葉蛋白，保證上樣量為1 200 μg，進行雙向電泳實驗[8-9]。

2 結果與討論

2.1 蛋白定量

圖2 BSA濃度與吸光度的線性關系Fig.2 The linear relationship between the absorbance and concentration of BSA

采用元素分析法測定新鮮建甌白筍及其竹葉總蛋白，其含水量分別為90.49%和52.40%。將50℃烘干的竹筍片和竹葉分別粉碎成粉狀用于元素分析測定，結果表明，干竹筍粉和竹葉粉的總蛋白含量分別為27.60%和14.60%，其新鮮建甌白筍及其竹葉總蛋白含量分別為2.62%和6.95%。為了進一步得到建甌白筍及其竹葉蛋白樣品的濃度并定量，采用紫外分光光度法測定了2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5 mg·mL-1BSA溶液的吸光度(595 nm)，結果如圖2所示。

由圖2可知， BSA的濃度與吸光度值之間存在良好的線性關系，y=0.0235x+0.2785 (R2=0.9951)。因此，采用該方法對建甌白筍及其竹葉蛋白樣品的濃度進行了測定，結果如表1所示。由表1可知，4組建甌白筍及其竹葉蛋白樣品的吸光度測定的RSD值分別為0.84%和1.28%，測定結果重復性好，其吸光度的平均值分別為0.540和0.513。然后，由方程y=0.0235x+0.2785計算出竹筍和竹葉蛋白樣品的濃度分別為11.13和9.98 mg·mL-1，提取量分別為33.4 mg和79.8 mg，提取率分別為2.23%和5.32%。因此。蛋白雙向電泳實驗所需上樣量分別為107.8和120.2 μL。

表1 建甌白筍及其竹葉蛋白樣品的測定Tab.1 Determination on protein concentration of the Jianou Moso bamboo shoots and leaves

2.2 雙向電泳

建甌白筍及其竹葉總蛋白的雙向電泳如圖3和圖4所示。由圖3和圖4可知，建甌白筍總蛋白含有1 626個蛋白點，而竹葉總蛋白含有900個蛋白點。建甌白筍為毛竹筍的1種，其蛋白點數明顯高于杭州市余杭區(qū)的毛竹冬筍(1 014個)[8]和覆蓋雷竹筍(812個)[9]。由圖4A可知，在pH=5～7時，建甌白筍及其竹葉蛋白點較多，分別為1 102個和589個，占總蛋白點的67.8%和65.4%，說明2種蛋白的等電點主要在pH=5～7。當pH<5時，建甌白筍及其竹葉蛋白點僅為177個(10.9%)和168個(18.7%)，說明2種蛋白在該范圍分布較少，其中在pH=4～5時，竹葉酸性蛋白點數(164)高于白筍(143)。當pH>7時，建甌白筍及其竹葉蛋白點為347個(21.3%)和143個(15.9%)，說明建甌白筍的堿性蛋白分布高于竹葉。由圖4B可知，在分子量為35～45 kDa時，建甌白筍及其竹葉蛋白點分布最為集中，分別達到382個(23.5%)和224個(24.9%)，明顯高于杭州市余杭區(qū)的毛竹冬筍(88個)[8]。建甌白筍及其竹葉蛋白的分子量主要分布在18～66 kDa，蛋白點個數分別為1 083(66.6%)和672(74.7%)，其它分子量范圍分布相對較少。結果表明，建甌白筍蛋白種類優(yōu)于竹葉蛋白，建甌白筍蛋白種類極其豐富(數量多于杭州余杭毛竹冬筍)。

圖3 建甌白筍(A)及其竹葉(B)總蛋白雙向電泳圖Fig.3 The 2-DE profile of total protein of Jianou Moso bamboo shoots (A) and leaves (B)

圖4 建甌白筍及其竹葉蛋白雙向電泳凝膠中不同等電點(A)和相對分子質量(B)的蛋白點數Fig.4 The protein spots for different isoelectric point distribution (A) and various molecular mass (B) in 2-DE gel of Jianou Moso bamboo shoots and leaves

3 結論

以建甌連地村同一顆毛竹的白筍和竹葉為研究對象提取總蛋白，采用Bradford法對蛋白樣品進行了濃度測定(竹筍：11.13 mg·mL-1；竹葉：9.98 mg·mL-1)，并進行了雙向電泳實驗(pH=3～10)，其上樣量分別為107.8和120.2 μL。

(1) 建甌白筍含有1 626個蛋白點，明顯多于杭州余杭毛竹冬筍(1 024個)和雷竹筍(812個)，且差異性較大，蛋白種類極其豐富；同時，竹葉的蛋白點數也高達900個；(2) 建甌白筍及其竹葉的等電點主要集中在pH=5～7，含蛋白點分別為1 102個和589個，占總蛋白點數的67.8%和65.4%；其分子量主要分布在18～66 kDa，蛋白點數分別為1 083個和672個，占總蛋白點數的66.6%和74.7%。

建甌白筍(毛竹筍)及其竹葉在天然植物蛋白利用方面具有潛在的應用前景。