黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物對小鼠腸黏膜氧化性的影響

谷盈睿，韋榮編，宋 茹*

(1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022)

納米氧化鋅與其他納米氧化物相比較，不僅物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，而且還具有價格低、生物兼容性好、毒性低等特點，因而納米氧化鋅在日常生活中應(yīng)用廣泛，如在化妝品、醫(yī)療器械、電子傳感器等方面[1]。黃鯽蛋白抗菌肽是黃鯽(Setipinnataty)蛋白水解產(chǎn)物，主要由肽類和氨基酸組成。研究表明，黃鯽蛋白抗菌肽具有抗菌、抗氧化和抑制腫瘤細(xì)胞增殖等作用[2-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，黃鯽蛋白抗菌肽與納米氧化鋅結(jié)合生成的新型納米復(fù)合物具有更強(qiáng)的抗菌效果。但是，在研究中人們也發(fā)現(xiàn)，黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物通過誘導(dǎo)大腸桿菌形成大量胞內(nèi)活性自由基而發(fā)揮抑菌作用[5]，而機(jī)體內(nèi)活性氧自由基生成量的增加可能對機(jī)體的氧化平衡造成一定影響。腸道是將機(jī)體內(nèi)部與外界環(huán)境分隔開來的生物屏障，是機(jī)體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，同時也是機(jī)體最大的免疫器官[6]。筆者以正常小鼠為模型，通過腸道結(jié)扎方式注射黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物，研究該絡(luò)合物對腸道黏膜關(guān)鍵性過氧化物酶的影響，同時測定脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量和脂質(zhì)過氧化物主要標(biāo)志物丙二醛(MDA)含量，旨在為黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物腸道吸收，以及后續(xù)關(guān)鍵酶活性影響機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物，浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院實驗室制備；髓過氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、LPO含量試劑盒、MDA含量試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；試驗用清潔級昆明種雌性、雄性小鼠(體重20 g左右)、基礎(chǔ)鼠糧、墊料，購于浙江省實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物微觀特征。透射電鏡法觀察黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物的微觀結(jié)構(gòu)特征，以納米氧化鋅粉末為對照。

1.2.2小鼠腸黏膜試驗設(shè)計。小鼠按照雌、雄分開，在專業(yè)動物房熟悉環(huán)境4 d，動物房溫度20～22 ℃，相對濕度40%～70%，保持通風(fēng)，每天光照/暗處各12 h，喂食基礎(chǔ)鼠糧，自由飲水。試驗前10 h對小鼠實施斷水、斷糧。試驗分對照組和樣品組，每組含雌、雄小鼠各2只，小鼠稱重后用乙醚麻醉，然后固定在專業(yè)解剖板上，使用消毒滅菌的解剖器材將其腸道拉出，用棉線結(jié)扎腸道的空腸段(3 cm左右)，用無菌注射器將0.2 mL黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅聚合物小心注射到空腸中，記錄時間。同時，將腸道塞回腹部，并用紗布遮蓋腹部以保持體溫和防止出血。當(dāng)時間到達(dá)30 min時，小鼠眼窩取血，拉出結(jié)扎的空腸段，用磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，然后刮取腸黏膜于定量冷磷酸鹽緩沖液中，備用。

1.2.3腸黏膜氧化性。分別測定對照組和樣品組小鼠腸黏膜液的MPO、GPx活性，LPO和MDA含量，具體測定方法參照試劑盒說明書進(jìn)行，其中腸黏膜液中蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford方法[7]。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=4)形式表示，用SPSS軟件對組間差異性進(jìn)行顯著分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物微觀結(jié)構(gòu)分析由圖1可以看出，納米氧化鋅具有多邊形或球形結(jié)構(gòu)，顆粒邊緣清晰(圖1a)，當(dāng)與黃鯽蛋白抗菌肽結(jié)合，形成的絡(luò)合物邊界模糊(圖1b)。透射電鏡視野下暗區(qū)部分代表了透射效果差的金屬離子，而淺色區(qū)域代表透射效果好的生物分子。由此可以看出，黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物中的納米氧化鋅主要被黃鯽蛋白抗菌肽包裹在內(nèi)部，而黃鯽蛋白抗菌肽在納米氧化鋅表面形成不規(guī)則的覆蓋層。根據(jù)文獻(xiàn)報道：在蛋白或肽類溶液中，納米粒子易被蛋白和肽分子包圍、修飾，在納米粒子表面形成聚合型生物膜層，這種生物膜層的形成不僅能夠降低納米粒子本身潛在的毒性，而且對其生物活性有提高作用[8-9]。例如：Keletemur等[10]報道納米氧化鋅粒子用牛血清白蛋白修飾能夠顯著降低納米氧化鋅的細(xì)胞毒性。最近研究中也報道了黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物的抑菌活性強(qiáng)于單獨的黃鯽蛋白抗菌肽和納米氧化鋅粒子[5]。

注：a.納米氧化鋅；b.黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物Note：a.nanoscale Zinc Oxide；b.Carassius auratus protein antibacterial peptide-nanoscale Zinc Oxide complex圖1 黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物透射電鏡分析Fig.1 Transmission electron microscopy analysis of the protein antibacterial peptide-nanoscale Zinc Oxide complex of the crucian carp

2.2小鼠腸黏膜氧化性變化MPO和GPx是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的重要過氧化物分解酶，它們含量的變化與機(jī)體的氧化水平有關(guān)。而LPO變化可以反映出機(jī)體不飽和脂肪酸鏈的氧化程度，其中MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一。小鼠空腸段吸收黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物30 min后，腸黏膜的氧化性變化情況如圖2所示。

注：a.髓過氧化物酶(MPO)；b.谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)；c.丙二醛(MDA)含量；d.脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量；圖中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=4)表示，“*”表示顯著性差異(P<0.05)Note：a.myeloperoxidase(MPO)；b.glutathione peroxidase(GPx)；c.malondialdehyde(MDA)content；d.lipid peroxide(LPO)content；data was expressed by mean value + standard deviation(n=4)，"*" showed significant differences(P<0.05)圖2 小鼠空腸段吸收黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物后腸黏膜的氧化性變化Fig.2 Changes in the intestinal mucosal oxidation in the intestinal mucosa of the Carassius auratus with the antibacterial peptide of the Carassius auratus and the nano Zinc Oxide complex in the jejunum of mice

圖2結(jié)果顯示，黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物對MPO和GPx的活性影響不同，其中對MPO活性有顯著促進(jìn)作用，而對GPx則是顯著地降低其活性(圖2a和2b)(P<0.05)。此外，黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物能顯著地提高M(jìn)DA的含量(圖2c)，而腸黏膜的LPO含量則是樣品組顯著低于對照組(P<0.05)(圖2d)。圖2結(jié)果說明，腸黏膜中2種重要的過氧化物酶MPO和GPx對黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物具有不同的敏感性，而與脂質(zhì)總體氧化程度有關(guān)的LPO在樣品組中含量是顯著低于對照組，說明黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物對腸黏膜的脂質(zhì)氧化程度有抑制作用，推測可能與MPO活性增強(qiáng)有關(guān)，而MDA含量的增加可能與GPx活性降低有關(guān)。

GPx主要包括4種：分別為胞漿GPx、血漿GPx、磷脂氫過氧化物GPx及胃腸道專屬性GPx。GPx的活力能反映機(jī)體的受損情況，是機(jī)體抗過氧化能力指標(biāo)之一[5]。該研究中測定的腸黏膜GPx屬于胃腸道專屬性GPx，其活性變化受腸道吸收物質(zhì)影響。在前期研究中人們報道了黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物在大腸桿菌模型細(xì)胞中能夠生成活性氧化型自由基，納米氧化鋅的抑菌作用與其自由基產(chǎn)生能

力，特別是過氧化氫形成有關(guān)[5]。根據(jù)圖2結(jié)果，推測GPx活性降低可能與黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物具有較強(qiáng)自由基生成能力有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致MDA含量的增加，但是MPO活性增加和LPO降低原因還有待于進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物的微觀結(jié)構(gòu)顯示，在納米氧化鋅表面有肽類生物分子層形成，對納米氧化鋅有包裹作用，而小鼠腸道注射了該絡(luò)合物后，腸黏膜中MPO活性增強(qiáng)，LPO含量降低；但是，另外一種過氧化物酶GPx的含量則是顯著地降低，同時MDA含量增加。該研究說明，黃鯽蛋白抗菌肽-納米氧化鋅絡(luò)合物對小鼠腸道關(guān)鍵酶活性有改變作用，但是具體吸收方式及酶活性改變機(jī)制還需后續(xù)深入探究。

[1] ALFADUL S M，ELNESHWY A A.Use of nanotechnology in food processing，packaging and safety-review[J].Afrcia journal of food agricultural and nutrion development，2010，10(6)：2719-2739.

[2] SONG R，WEI R B，ZHANG B，et al.Optimization of the antibacterial activity of half-fin anchovy(Setipinnataty)hydrolysates[J].Food bioprocess and technology，2012，5(5)：1979-1989.

[3] SONG R，WEI R B，RUAN G Q，et al.Isolation and identification of antioxidative peptides from peptic hydrolysates of half-fin anchovy(Setipinnataty)[J].LWT-Food Science and Technology，2015，60(1)：221-229.

[4] SONG R，WEI R B，ZHANG B，et al.Antioxidant and antiproliferative activities of heated sterilized pepsin hydrolysate derived from half-fin anchovy(Setipinnataty)[J].Marin drugs，2011，9(6)：1142-1156.

[5] SONG R，SHI Q Q，ABDRABBOH G A A，et al.Characterization and antibacterial activity of the nanocomposite of half-fin anchovy(Setipinnataty)hydrolysates/zinc oxide nanoparticles[J].Process biochemistry，2017，62：223-230.

[7] BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical biochemistry，1976，72(1/2)：248-254.

[8] BHUNIA A K，KAMILYA T，SAHA S.Synthesis，characterization of ZnO nanorods and its interaction with albumin protein[J].Materials today：Proceedings，2016，3(2)：592-597.

[9] DOCTER D，WESTMEIER D，MARKIEWICZ M，et al.The nanoparticle biomolecule corona：Lessons learned-challenge accepted?[J].Chemical society reviews，2015，44(17)：6094-6121.