褪黑素增強(qiáng)鹽害條件下水稻幼苗對稻瘟病的抗病能力

許秋怡，陳兆暉，季富宴，時浩杰

(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 311300)

褪黑素是一種重要的植物生長調(diào)控劑，能促進(jìn)植物抗病以及抗各種非生物脅迫[1-2]，可促進(jìn)植物種子在逆境下發(fā)芽[1]，還可促進(jìn)老化的種子恢復(fù)活力[3]。對于褪黑素具有的這些多重功能，其主要調(diào)控機(jī)理是因為它不但能直接清除活性氧，還能調(diào)控抗氧化酶基因表達(dá)[1-2]。此外，褪黑素還能調(diào)控植物抗病信號途徑如水楊酸信號途徑等[2]。

植物不同于動物，為了抵御來自于環(huán)境中的非生物脅迫(干旱、鹽害、水澇、紫外線、重金屬等)及生物脅迫(病原菌和蟲害等)，它們在長期的進(jìn)化過程中發(fā)展出一套精細(xì)、高效和完整的防衛(wèi)系統(tǒng)[4]。在抵御非生物脅迫中，為消除活性氧自由基的毒害，所有有氧植物都進(jìn)化出能清除這些毒害分子的抗氧化酶[如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POX)等]和抗氧化代謝物質(zhì)[如類胡蘿卜素、維生素C、維生素E、谷胱甘肽(GSH)等][5]。類似地，植物在抵抗病害過程中，同樣有很多防衛(wèi)酶[如多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等]和次生代謝物(酚類物質(zhì)等)參與抵御反應(yīng)[6]。當(dāng)然，也有文獻(xiàn)報道抗氧化酶在植物抗病過程中發(fā)揮一定作用[7]。在自然環(huán)境條件下，植物很少只面臨單一的環(huán)境脅迫，往往幾種脅迫因子同時出現(xiàn)[8-9]。例如，水澇條件下又面臨著病害的出現(xiàn)，干旱條件下又面臨著蟲害的威脅。一般來講，植物同時遭遇2種及2種以上較嚴(yán)重的環(huán)境脅迫時，后果是很嚴(yán)重的，往往導(dǎo)致植物死亡[8]。

水稻是我國南方和東北主要的農(nóng)作物。在東北，水稻種植往往同時面臨低溫、鹽堿以及病害等多重危害。其中，稻瘟病是一種危害極嚴(yán)重的病害[10]。這種真菌病害的發(fā)病嚴(yán)重程度除了與其生理小種致病力和水稻品種抗病力有關(guān)外，更與環(huán)境因素有密切關(guān)系。低溫能導(dǎo)致水稻抗稻瘟病能力顯著下降，而氮肥的過多施加也會導(dǎo)致其發(fā)病更嚴(yán)重[11-16]。目前對于作物應(yīng)答單一脅迫的研究較多，對于多重脅迫的應(yīng)答研究較少[8-9]。而鹽害和病害都會誘導(dǎo)植物產(chǎn)生活性氧從而為害植物生長[17-18]。此外，一些保護(hù)酶如SOD、POX、PPO在植物抗病抗逆中發(fā)揮著重要作用[19]。鑒于此，筆者在生理水平上對鹽脅迫條件下的水稻先噴灑褪黑素，然后接種稻瘟菌，觀察了其抗病反應(yīng)，以期為了解褪黑素對逆境下作物抗病的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料選取水稻品種中早39秈稻15日齡幼苗為植物材料。菌種為稻瘟菌ZB15，為國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)鑒定生理小種。

1.2方法

1.2.1水稻幼苗培養(yǎng)。采用實驗室水培方法。將發(fā)芽7 d左右(3葉期)的水稻幼苗從沙土中轉(zhuǎn)移到塑料盆中(事先放置有鉆孔的有機(jī)泡膜)，盆中加有1/10強(qiáng)度的Hoagland營養(yǎng)液。將全部塑料盆置于培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度為250 μmol/(m2·s)，每天光照12 h。晝夜溫度分別為30/20 ℃。待水稻苗適應(yīng)性生長14 d后，清除生長不良的苗子，其他生長一致的健康苗子供處理用。

1.2.2菌種及其活化。參照董漢松[20]教授主編的《植病研究方法》，采用燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)稻瘟菌孢子。向平板中無污染的稻瘟菌菌落加適量滅菌后的蒸餾水，并置于光照下促進(jìn)孢子生成。孢子使用前用蒸餾水洗下，稀釋到1×106個/mL的濃度水平。為促進(jìn)孢子更好地吸附到水稻葉片上，在孢子的稀釋液中加0.02%吐溫-20，混合均勻后，置于噴壺中，用于水稻葉片噴霧處理。

1.2.3接菌處理。將15日齡的水稻幼苗移到含有50 mmol/L NaCl的1/10強(qiáng)度Hoagland營養(yǎng)液中適應(yīng)性培養(yǎng)4 d，對幼苗噴灑不同濃度(0、0.1和1.0 mmol/L)褪黑素，12 h后接種事先活化的稻瘟菌，再置于溫室條件下(注意保濕)觀察其發(fā)病情況。對照組為不含NaCl的營養(yǎng)液中接種稻瘟菌。

1.2.4保護(hù)酶活力檢測。參照張蜀秋[21]主編的《植物生理學(xué)實驗技術(shù)教程》上的實驗方法，對不同時期(噴灑褪黑素后0、24和48 h)的葉片取樣檢測酶活力。SOD酶活力測定：收集200 mg水稻幼苗第3片葉，在預(yù)冷的研缽中加入2 mL PBS緩沖液(pH 7.0)，在冰塊上研磨成勻漿，加入緩沖液至5 mL，在4 ℃下12 000 r/min離心30 min，上清液即為SOD抽提液，置于冰箱中保存待測。利用NBT法在560 nm處比色獲取吸光值，每個酶活力單位定義為將NBT還原抑制到對照50%時所需的酶量。PPO酶活力測定：稱取1 g水稻幼苗第3片葉組織，用5 mL 預(yù)冷的50 mmol/L PBS磷酸緩沖液(pH 7.8)研磨，再加入5 mL緩沖液洗下，倒入20 mL離心管中，4 ℃、14 000 r/min離心30 min，收集上清。所用反應(yīng)體系為3 mL 200 mmol/L鄰苯二酚(用pH 7.8磷酸緩沖液配制)、1 mL酶液，以滅活的酶液為空白對照，25 ℃水浴20 min，立即用20%三氯乙酸中止反應(yīng)。在14 000 r/min下離心10 min，用分光光度計在495 nm處測定吸光度。1個酶活力單位定義為0.1個OD吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1在鹽害條件下褪黑素增強(qiáng)對稻瘟病的抗病能力采用每株水稻苗上的平均病斑數(shù)評價抗病能力。病斑數(shù)越多表示抗病能力越弱，反之亦然。取5株幼苗在接菌后7、14和21 d病斑數(shù)的平均值。由圖1可知，與對照相比，鹽害顯著降低了水稻對稻瘟病的抵抗力，7、14和21 d病斑數(shù)分別比對照增加了125%、145%和172%。然而，噴灑低濃度(0.1 mmol/L)和高濃度(1.0 mmol/L)褪黑素則顯著增強(qiáng)了水稻在鹽害條件下的抗病能力，第21天病斑數(shù)分別比鹽害對照減少了27%和42%。這說明噴灑褪黑素能顯著增強(qiáng)水稻幼苗在鹽害條件下的抗稻瘟病的能力。

圖1 鹽害條件下噴灑褪黑素后水稻稻瘟病的發(fā)病情況Fig.1 The occurrence condition of rice blast under salt stress after spraying melatonin

2.2褪黑素增強(qiáng)保護(hù)酶活力水稻幼苗噴灑褪黑素后0、24和48 h取其第3片葉測定SOD和PPO活力。由圖2可知，鹽害顯著降低了SOD活力。接菌后有輕微上升，然后噴灑低濃度褪黑素后，酶活力顯著上升。噴灑褪黑素24和48 h后，相對于鹽害+稻瘟菌組，鹽害+稻瘟菌+褪黑素組的葉片酶活力分別上升了72%和92%。PPO活力趨勢與SOD相同，噴灑褪黑素24和48 h后，相對于鹽害+稻瘟菌組，鹽害+稻瘟菌+褪黑素組的葉片PPO活力分別上升了38%和47%(圖3)。

圖2 噴灑褪黑素后水稻幼苗的SOD活力Fig.2 SOD activity of rice seedlings after spraying melatonin

圖3 噴灑褪黑素后水稻幼苗的PPO活力Fig.3 PPO activity of rice seedlings after spraying melatonin

3 結(jié)論與討論

植物在其生命周期中面臨著三大任務(wù)：生長、防衛(wèi)以及繁殖。在進(jìn)入繁殖階段以前的苗期階段，生長和防衛(wèi)是2個主要的任務(wù)[22]。一般來講，當(dāng)植物面臨環(huán)境脅迫(非生物和生物脅迫)時，其生長會受到不同程度的抑制。這可能一方面與其光合作用受到抑制有關(guān)，另一方面也與其將更多的資源(如光合作用產(chǎn)物)轉(zhuǎn)移投放到防衛(wèi)物質(zhì)合成而非生長上有關(guān)[23]。而當(dāng)同時面臨2種脅迫，如鹽害和病害時，除不得不增加更多防衛(wèi)物質(zhì)合成外，還存在如何將這些資源合理分配到這兩類不同性質(zhì)的防衛(wèi)物質(zhì)的合成上的問題[23]。相對于單一脅迫，2種脅迫中的任何一種脅迫防衛(wèi)能力都將相應(yīng)被削弱。該研究也表明，鹽害作為一種嚴(yán)重的非生物脅迫，會顯著削弱水稻對病害的抵抗能力。這可能與降低相關(guān)保護(hù)酶(如SOD和PPO)活力有密切關(guān)系。SOD是最主要的活性氧清除酶，與植物抗逆境脅迫(如干旱、鹽害等)有密切關(guān)系[5]，也與植物抗病有密切關(guān)系。PPO主要與植物抗病有密切關(guān)系。該酶通過參與催化多酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的合成發(fā)揮抗病作用[7]。在該試驗中，因為涉及到鹽害和病害，所以選擇這2個有典型代表性的指標(biāo)作為主要研究對象。

褪黑素有多種調(diào)控作用，它既可以直接清除活性氧，減輕植物傷害，還能調(diào)控包括抗氧化酶在內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)[1]。該研究中，將褪黑素噴灑幼苗后，能顯著增強(qiáng)其對稻瘟菌的抵抗能力，對于其機(jī)理的探討，著重從保護(hù)酶水平進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其能顯著增強(qiáng)保護(hù)酶的活力。對于其促進(jìn)這2個酶活力的機(jī)制，除了其自身能清除活性氧從而減輕活性氧對2種酶的傷害外[1]，可能也與其能從基因水平調(diào)控這2個酶的基因表達(dá)有密切關(guān)系[1]。事實上，褪黑素本身就具有調(diào)控抗氧化酶(如SOD、CAT等)活力的能力[1]，還能誘導(dǎo)水楊酸等信號途徑[2]，而水楊酸信號途徑的激活也會促進(jìn)水稻抗稻瘟病[24]。今后需進(jìn)一步從分子水平研究褪黑素對保護(hù)酶基因的調(diào)控機(jī)制，以及如何調(diào)控水楊酸信號途徑從而發(fā)揮其在鹽害條件下促進(jìn)水稻抵抗稻瘟菌侵襲的能力。

綜上得出以下結(jié)論：①鹽害能顯著降低水稻對稻瘟病的抵抗能力；②鹽害也會降低SOD和PPO的活力；③褪黑素處理水稻幼苗，能增強(qiáng)其抗稻瘟病的能力，同時激活SOD和PPO的活力。

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