煙草根際溶磷解鉀細菌的篩選鑒定及對煙草的促生作用

徐立國 方換男 肖云峰 王汝法 劉愛新 李現(xiàn)道 劉春菊

摘要：本試驗以山東濰坊煙田土壤為研究對象，對其根際溶磷解鉀細菌進行篩選鑒定并分析該類細菌對煙草生長的影響。結(jié)果顯示：（1）從山東濰坊煙田土壤樣品分離得到34個細菌分離物。以煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）和煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）為指示菌，篩選出對2種病原菌有良好拮抗效果的菌株13株。（2）測定發(fā)現(xiàn)8株菌株具有良好的溶磷能力，菌株培養(yǎng)液中可溶性磷含量最高為241 mg/L。5株菌株具有解鉀能力，菌株培養(yǎng)液中速效鉀含量最高為13.95 mg/L。5株菌株具有產(chǎn)IAA能力，最高IAA產(chǎn)量為104.71 μg/mL。（3）菌株H1-2、3183可明顯促進煙草生長，其澆灌后的煙草地上部和地下部鮮重均高于對照。（4）經(jīng)16S rDNA序列系統(tǒng)進化分析得出，菌株3183和1441為貝萊思茅芽孢桿菌（Bacillus velezensis），菌株H1-2為多黏類芽孢桿菌（Peanibacillus polymyxa），菌株G2-7和D2為伯克霍爾德氏菌（Burkholderia spp.）。

關(guān)鍵詞：煙草；植物根際促生菌；溶磷；解鉀；鑒定

中圖分類號：S572：S154.39文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）03-0107-06

Abstract In this experiment， the soil of Weifang tobacco field in Shandong was taken as the research object， the phosphate- and potassium- solubilizing bacteria in the rhizosphere were screened and identified and their effects on the growth of tobacco were analyzed. The results showed that 34 bacteria isolates were obtained from tobacco rhizosphere soil and 13 strains showed better antagonistic effects to both Phytophthora parasitica and Ralstonia solanacearum. The phosphate- and potassium- solubilizing capabilities of those isolates were tested， and 8 strains showed better phosphate-solubilizing activity and 5 strains showed potassium-solubilizing activity. The highest content of soluble phosphate and available potassium was 241 mg/L and 13.95 mg/L respectively. Five strains showed the activity to produce indole acetic acid （IAA） and the highest concentration of IAA was 104.71 μg/mL. H1-2 and 3183 strains could obviously promote the growth of tobacco. The aboveground and underground fresh weight of tobacco seedlings irrigating with these bacteria solution were both higher than those of control. Through comparison of the 16S ribosomal DNA and phylogenetic analysis， 3183 and 1441 strains belonged to Bacillus velezensis， H1-2 strain belonged to Peanibacillus polymyxa， and G2-7 and D2 strains belonged to Burkholderia spp. respectively.

Keywords Tobacco；Plant growth-promoting rhizobacteria；Phosphate solubilization；Potassium solubilization；Identification

植物根圍存在多種類型的微生物，可以通過溶磷、解鉀和分泌植物激素等方式促進植物生長，同時也可通過競爭、拮抗作用和誘導(dǎo)植物抗病性來發(fā)揮防病作用[1]。因此，這類微生物在改善土壤微生態(tài)、促進植物生長和防治植物病害等方面具有重要潛力，常被稱為植物根際促生菌（PGPR）[2]。已有多種PGPR菌株作為微生物肥料或用于植物病害生物防治并取得良好效果[2，3]。

山東煙區(qū)是連作多年的老煙區(qū)，長期連續(xù)栽培導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失調(diào)、增產(chǎn)效應(yīng)下降、多種病原菌在土壤中持續(xù)積累、煙草黑脛病和青枯病等土傳病害逐年加重，對煙葉生產(chǎn)造成重大損失。針對上述問題，本研究從山東濰坊煙田土壤中篩選多株細菌菌株并對其溶磷、解鉀及促生作用進行分析，以期為進一步開發(fā)應(yīng)用該類微生物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

5份供試土樣采自濰坊煙區(qū)煙草根際土壤。供試煙草品種為NC89。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌菌株的分離 采用平板稀釋法將土樣進行稀釋，參照文獻[4]的方法對分離純化的菌株進行抑菌活性測定。首先將純化的菌株在NA[5]平板上劃線，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，刮取菌苔、用無菌水稀釋至OD600為0.5，取10 μL菌懸液接于PDA[5]平板中心，28℃培養(yǎng)48 h，備用。

1.2.2 細菌菌株抑菌活性測定 對分離得到的菌株進行煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）和青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）抑菌活性測定。煙草黑脛病菌抑菌活性測定方法：在待測細菌菌落兩側(cè)各接入一片病原菌絲塊（直徑5 mm），于28℃繼續(xù)培養(yǎng)2～5 d后，測量抑菌圈直徑[4]。青枯雷爾氏菌拮抗活性的測定采用菌懸液噴霧法，將濃度為1×106 cfu/mL的青枯雷爾氏菌菌懸液用微量噴霧器均勻噴在PDA平板上[4]。每處理重復(fù)3次。

1.2.3 細菌菌株溶磷能力測定 采用溶磷圈法檢測各菌株的溶磷活性[6]。將各菌株制成菌懸液（OD600約為0.5），取10 μL點接于以Ca3（PO4）2為唯一磷源的PVK培養(yǎng)基中心，置于 28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～5 d 后，觀察溶磷圈大小，根據(jù)菌落周圍溶磷圈半徑大小初步確定各菌株是否具有溶磷活性。每處理重復(fù)3次。

參照文獻[6]的方法測定各菌株的溶磷能力。將顯示溶磷活性的菌株接種于NBRIP培養(yǎng)液中，于28℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)，間隔24 h取樣，共測5 d。將培養(yǎng)液離心去除菌體，取上清液稀釋，后用鉬銻抗比色法測定上清液中可溶性磷含量。以未接種菌株的培養(yǎng)液為對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]計算可溶性磷含量。

1.2.4 細菌菌株解鉀能力測定 參照文獻[7]的方法檢測各菌株的解鉀活性。取各菌株菌懸液（OD600約0.5）10 μL點接在以鉀長石粉為唯一鉀源的培養(yǎng)基[8]上，28℃培養(yǎng)5 d，觀察透明圈的有無和大小，確定是否具有解鉀活性。每處理重復(fù)3次。

參照文獻[8]的方法將顯示解鉀活性的菌株接種到硅酸鹽培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)，分別于48、72、96、120 h取樣，10 000 r/min離心15 min除去菌體和殘渣，取上清液用火焰光度計測不同培養(yǎng)時間速效鉀含量。每處理重復(fù)3次。同樣以未接種菌株的培養(yǎng)液為對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]計算速效鉀含量。

1.2.5 IAA定量測定 按照文獻[10]的方法測定不同菌株IAA產(chǎn)量：取OD600為0.5的菌株菌懸液100 μL加入到含有L-色氨酸（1 000 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基[8]中，28℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)，分別于不同時間吸取1 mL的菌懸液至1.5 mL離心管，離心去除菌體，取800 μL上清液至無菌的10 mL離心管，同時加1 600 μL Salkowski比色液，以無菌水為對照。室溫、避光放置25 min 后，分光光度計測定反應(yīng)液在540 nm 的吸光值，根據(jù)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]比較不同菌株在不同時間的IAA產(chǎn)量。每菌株3次重復(fù)。

1.2.6 細菌菌株對煙草幼苗的促生作用 挑取不同菌株分別于NA培養(yǎng)基28℃下培養(yǎng)48 h，用無菌水收集菌體、調(diào)節(jié)菌懸液濃度至1×108 cfu/mL備用。將菌懸液灌根處理5—6葉期的煙苗，以等量無菌水灌根為對照。每棵煙苗用量為50 mL，每處理10棵煙苗，間隔7 d處理1次，共處理3次。于末次處理后7 d觀察記錄幼苗生長情況、株高、地上部和地下部鮮重等指標(biāo)。

1.2.7 細菌菌株的鑒定 隨機選擇部分細菌菌株分別在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng) 48 h，離心收集菌體。使用MiniBEST Bacterial gDNA試劑盒（TaKaRa）提取細菌基因組DNA，后對其DNA用通用引物（27F/1492R，27F：5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行16S rRNA擴增，PCR產(chǎn)物回收、測序后，與GenBank中已報道的相同基因進行對比分析，用分析軟件DNAMAN v5.2.2進行序列同源性分析，MEGA 5.0進行系統(tǒng)進化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌菌株的分離和抑菌活性

從煙草根系土壤分離獲得34個細菌分離物，經(jīng)平板對峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)13株細菌菌株對煙草黑脛病菌和青枯雷爾氏菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性，抑菌圈直徑均在1.2 cm以上。其中，菌株D2和G2-7對黑脛病菌的抑菌半徑分別為1.4、1.5 cm，菌株3183和G2-7對青枯雷爾氏菌的抑菌半徑分別為1.8 、2.0 cm ，可見這些菌株對煙草青枯病菌和黑脛病菌有較好的抑制作用。部分菌株的抑菌作用見圖1。

2.2 細菌菌株溶磷能力分析

13株有抑菌活性的細菌菌株經(jīng)PVK培養(yǎng)基培養(yǎng)后，有 8株菌株在培養(yǎng)基上可產(chǎn)生明顯的溶磷圈。培養(yǎng)5 d后溶磷圈直徑大于2.0 cm的菌株有6株，最大直徑在4.7 cm，部分菌株的溶磷效果見圖2。

從8株溶磷菌株中選擇4株菌株對其溶磷能力進行定量測定，發(fā)現(xiàn)各菌株培養(yǎng)48 h后菌株培養(yǎng)液中可溶性磷含量最高。菌株G2-7、D2培養(yǎng)液中可溶性磷最高含量可達226、241 mg/L，菌株T11、T14-1分別為113.3 、118.2 mg/L（圖3）。

2.3 細菌菌株解鉀能力測定

13株有抑菌活性的細菌菌株中有5株可形成明顯的透明圈，其中4株細菌菌株的解鉀效果見圖4，表明這些菌株具有溶解鉀的能力。定量測定發(fā)現(xiàn)，菌株H1-2、1441解鉀活性較好，菌液中速效鉀含量分別為11.2～13.76、10.61～13.95 mg/L，菌株3183為4.12～5.50 mg/L，解鉀能力相對較弱（圖5）。

2.4 部分細菌菌株產(chǎn)IAA能力測定

5株參試菌株均具有產(chǎn)生IAA的能力，其在96 h 產(chǎn)生IAA量如圖6所示，可見菌株3183的IAA產(chǎn)生量最高，約為104.71 μg/mL，其次為菌株1441，產(chǎn)生量為 86.42 μg/mL，其余菌株的產(chǎn)生量相對較低。

2.5 部分細菌菌株對煙草幼苗的促生作用

經(jīng)不同菌株處理后，煙草幼苗與對照差別明顯，其中菌株H1-2、3183處理后煙草植株的地上部和地下部鮮重均有明顯提高，地上部鮮重分別比對照增加28.98%、28.91%，地下部鮮重增加22.73%、44.78%（表1），最大葉片面積和株高也有明顯增加。

2.6 部分細菌菌株16S rDNA序列分析

由圖7可知，菌株3183、1441與Bacillus velezensis位于同一分支，表明這2株菌株與Bacillusvelezensis親緣關(guān)系最近，為貝萊斯芽孢桿菌；菌株H1-2為多黏類芽孢桿菌（Peanibacillus polymyxa）；菌株G2-7、D2為伯克霍爾德氏菌（Burkholderia spp.）。

3 討論與結(jié)論

磷（P）是植物生長發(fā)育所必須的大量元素，參與細胞多種生命活動，對植物生長發(fā)育具有重要作用。土壤中的無機磷常被Fe或Ca等金屬離子結(jié)合、固定而不能被植物吸收利用，而土壤中的PGPR可將被固定的磷溶解、釋放，提高植物對P的吸收和利用率[10-12]。Kaur等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Pantoea cypripedii等細菌能夠促進植株生長、提高玉米和小麥產(chǎn)量。Ren等[14]從楊樹莖內(nèi)分離的B. pyrrocinia JK-SH007不僅對楊樹潰瘍病有良好的防治效果，而且可以促進楊樹幼苗生長。因而PGPR菌株作為生物肥料應(yīng)用有很大潛力。

鉀（K）作為大量元素之一，不但能促進煙草生長，而且對提高煙葉品質(zhì)具有重要作用。據(jù)報道，土壤中90%～98%的鉀以鉀長石或云母等含鉀礦物質(zhì)形式存在，只有1%～2%的K可以被植物直接吸收利用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus spp.和Pseudomonas spp.等多種PGPR菌株具有解鉀能力，對土壤中鉀的釋放起重要作用 [15-18]。本研究從煙草根圍獲得的B. velezensis、P.polymyxa和Burkholderia spp.等菌株也表現(xiàn)出較高的溶磷和解鉀能力，菌株菌液中速效鉀含量最高達到13.95 mg/L，與Zhang等報道的菌株解鉀能力相當(dāng)[19]，而有關(guān)這些菌株的解鉀機理及應(yīng)用等還需要進一步研究。

本研究從山東濰坊煙區(qū)分離獲得對黑脛病菌、青枯雷爾氏菌有抑菌活性的細菌菌株13株，其中部分菌株能夠溶磷、解鉀、產(chǎn)生IAA。室內(nèi)盆栽試驗發(fā)現(xiàn)菌株H1-2、3183對煙草生長有明顯的促進作用。16S rDNA序列分析和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，所獲得的菌株分別為Bacillus velezensis、Peanibacillus polymyxa 和Burkholderia spp.，其中溶磷菌株均為Burkholderia spp.。

參 考 文 獻：

[1] 林啟美，趙小蓉，孫焱鑫，等.四種不同生態(tài)系統(tǒng)的土壤解磷細菌數(shù)量及種群分布[J]. 土壤與環(huán)境， 2000，9 （1）：34-37.

[2] 朱培淼，楊興明，徐陽春，等. 高效解磷細菌的篩選及其對玉米苗期生長的促進作用 [J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2007，18（1）：107-112.

[3] Pérez-Montao F， Alías-Villegas C， Bellogín R A， et al. Plant growth promotion in cereal and leguminous agricultural important plants： from microorganism capacities to crop production[J]. Microbiological Research， 2014，169（5/6）：325-336.

[4] 韓超， 武貴元，劉愛新， 等.生姜莖基腐病病原拮抗細菌的篩選與鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，44（11）：84-89.

[5] 程麗娟，薛泉宏.微生物學(xué)實驗技術(shù)[M]. 西安： 世界圖書出版公司， 2000.

[6] Ji S H， Gururani M A， Chun S C. Isolation and characterization of plant growth promoting endophytic diazotrophic bacteria from Korean rice cultivars[J]. Microbiological Research， 2014， 169（1） ：83-98.

[7] Saha M， Maurya B R， Meena V S， et al. Identification and characterization of potassium solubilizing bacteria （KSB） from Indo-Gangetic Plains of India[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology， 2016，7： 202-209.

[8] Sugumaran P， Janarthanam B. Solubilization of potassium containing minerals by bacteria and their effect on plant growth[J]. World J. Agric. Sci.， 2007， 3（3）： 350-355.

[9] Archana D S， Nandish M S， Savalagi V P， et al. Characterization of potassium solubilizing bacteria（KSB） from rhizosphere soil[J]. Bioinfolet， 2013， 10： 248-257.

[10]Wani P A， Khan M S， Zaidi A. Synergistic effect of the inoculation with nitrogen-fixing and phosphate-solubilizing rhizobacteria on performance of field-grown chickpea[J]. J. Plant Nutr. Soil Sci.，2007，170：283-287.

[11]Hariprasad P， Niranjana S R. Isolation and characterization of phosphate solubilizing rhizobacteria to improve plant health of tomato[J]. Plant Soil， 2009，316：13-24.

[12]Hameeda B， Harini G， Rupela O P， et al. Growth promotion of maize by phosphate-solubilizing bacteria isolated from compost and macrofauna[J]. Microbiological Research，2008，163（2）：234-242.

[13]Kaur G， Reddy M S. Influence of P-solubilizing bacteria on crop yield and soil fertility at multilocational sites[J]. European Journal of Soil Biology，2014， 61： 35-40.

[14]Ren J H， Ye J R， Liu H， et al. Isolation and characterization of a new Burkholderia pyrrocinia strain JK-SH007 as a potential biocontrol agent[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2011， 27（9）： 2203-2215.

[15]Son J S， Sumayo M， Hwang Y J， et al. Screening of plant growth-promoting rhizobacteria as elicitor of systemic resistance against gray leaf spot disease in pepper[J]. Applied Soil Ecology， 2014，73 ：1-8.

[16]Meena V S， Maurya B R， Verma J P. Does a rhizospheric microorganism enhance K+ availability in agricultural soils？ [J]. Microbiological Research， 2014， 169（5/6）： 337-347.

[17]Zorb C， Senbayram M， Peiter E.Potassium in agriculture – status and perspectives[J]. J. Plant Physiol.， 2014， 171（9）： 656-669.

[18]Meena V S， Maurya B R， Verma J P，et al. Potassium solubilizing rhizobacteria（KSR）： isolation， identification， and K-release dynamics from waste mica[J]. Ecological Engineering， 2015，81：340-347.

[19]Zhang C S， Kong F Y. Isolation and identification of potassium-solubilizing bacteria from tobacco rhizospheric soil and their effect on tobacco plants[J]. Appl. Soil Ecol.， 2014， 82：18-25.