堿性肥料對土壤微生物多樣性及香蕉枯萎病發(fā)生的影響

李 進，樊小林，藺 中

（1 廣東海洋大學化學與環(huán)境學院，廣東湛江 524088；2 華南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院/廣東高校環(huán)境友好型肥料工程技術研究中心，廣東廣州 510642）

香蕉是我國南亞熱帶地區(qū)的大宗水果。改革開放以來，我國香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，已成為我國南亞熱帶地區(qū)農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。但是，近年來我國各香蕉主產(chǎn)區(qū)由于香蕉枯萎病4號生理小種 (FOC)的爆發(fā)，導致主產(chǎn)區(qū)香蕉枯萎病愈演愈烈，嚴重影響香蕉生產(chǎn)，我國香蕉產(chǎn)量從2011年的1039.81萬t迅速下降到2014年的908萬t，因此香蕉枯萎病已經(jīng)威脅到我國香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

香蕉枯萎病又稱黃葉病、巴拿馬病，是由尖孢鐮刀菌古巴專化型侵染引起的維管束病害[2]，屬于真菌類土傳病害，容易在土壤pH 6以下、肥力低的砂質(zhì)、砂壤酸性土壤中發(fā)作[3]，其致病力強、孢子存活時間長，一旦發(fā)病即有毀滅性危害。目前我國蕉園由于長期大量施用銨態(tài)氮、氯化鉀等酸性或生理酸性常規(guī)化肥而加劇土壤酸化[4]。研究表明土壤酸化會抑制細菌和放線菌等土壤有益微生物的生長，而有利于喜酸性土壤的真菌類有害微生物，如香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌的生存和繁殖[5]；同時，常規(guī)化肥的施用也會引起某些土壤微生物的富集和另一些微生物物種的喪失，會在發(fā)病初期加重香蕉枯萎病的病情[6]。因此，解決香蕉園長期大量施用化肥所引起的土壤酸化是防止香蕉枯萎病危害及蔓延的關鍵。已有大量研究表明，利用石灰調(diào)節(jié)香蕉園土壤酸度，同時配合施用化學肥料可以有效防控香蕉枯萎病[7-8]。但在生產(chǎn)實踐中果農(nóng)認識到，石灰雖能有效調(diào)節(jié)酸度，但不能連年施用，否則就會因為產(chǎn)生碳酸鈣和硫酸鈣沉淀而導致土壤板結。為此，本研究室研發(fā)了既可調(diào)節(jié)土壤酸度，又可供給香蕉生長所需養(yǎng)分的堿性肥料，該肥料不會產(chǎn)生碳酸鈣和硫酸鈣沉淀，同時具有治酸改土和營養(yǎng)作物的功能。前期有關堿性肥料調(diào)節(jié)香蕉園土壤酸度及防控香蕉枯萎病效果和機理的研究結果表明：堿性肥料相比常規(guī)化肥可以有效地提高香蕉園土壤pH值，并降低香蕉枯萎病發(fā)病率及病情指數(shù)[9]；施用堿性肥料提高土壤pH值后，土壤中細菌和放線菌的數(shù)量增加，而包括香蕉尖孢鐮刀菌在內(nèi)的真菌數(shù)量減少[10]；堿性肥料改變了病區(qū)土壤中原有微生物的種群數(shù)量和結構后，將可能引起土壤微生物總體活性和多樣性的變化。也有研究表明豐富的土壤微生物多樣性可降低土傳植物病害的發(fā)生[11]，提高土壤微生物活性有利于形成高肥力的土壤[12]。然而迄今尚沒有關于肥料酸堿性對土壤微生物多樣性影響的深入研究。為進一步探究堿性肥料防控香蕉枯萎病以及提高香蕉產(chǎn)量的機理，本文采用Biolog-ECO技術研究了不同pH值肥料對土壤微生物種群數(shù)量和活性以及功能多樣性的影響，為施用堿性肥料防治香蕉枯萎病、恢復病區(qū)蕉園土地生產(chǎn)力和提高香蕉產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試基質(zhì)：供試基質(zhì)為土壤和椰糠按1∶1比例混合而成的混合基質(zhì)土。供試土壤采自華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場赤紅壤發(fā)育的稻田，供試椰糠為從印度進口的無病椰糠。供試混合基質(zhì)土的pH值為5.59，有機質(zhì)為17.09 g/kg，速效氮56.59 mg/kg，有效磷59.57 mg/kg，速效鉀315.4 mg/kg。供試容器是130 mm ×120 mm × 120 mm的黑色營養(yǎng)缽，每缽裝混合基質(zhì)土0.5 kg。

供試作物：巴西蕉 (Musa AAA Giant Cavendish cv. Baxi) 組培袋裝香蕉苗。移栽前在溫室培養(yǎng)至6葉期，然后選取生長相對一致的香蕉苗進行試驗處理。

供試香蕉枯萎病病原菌：由華南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院植物病理研究室自行篩選，屬于尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種[Fusarium oxysporum f.sp. cubensce (E. F. Smith) Snyder et Hasen]。接種懸浮液香蕉枯萎病菌孢子液的濃度為1 × 107cfu/mL。

供試肥料：由廣東省高校環(huán)境友好型肥料工程技術研究中心研發(fā)的pH為5.5、7.0、8.0的三種NPK復合肥 (22-8-15)。其中pH 5.5的為酸性常規(guī)肥料，pH 7.0的是中性常規(guī)肥料，pH 8.0的則是堿性復合肥料。

1.2 試驗設計

試驗于2013年9月，在廣州華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院溫室 (E113°21′28″，N23°09′40″) 中進行，采用兩因素裂區(qū)設計。主處理為3個pH值的氮磷鉀復合肥 (22-8-15)，pH值分別為5.5、7.0、8.0，每個處理的施肥量相等，即每盆按照處理要求分別澆灌pH值不等的氮磷鉀復合肥水溶液50 mL，溶液的肥料濃度為0.6% (用水將復合肥稀釋至0.6%)，移栽后每周澆灌一次，每次每盆澆灌量相等；副處理為香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌，包括不接種FOC、接種FOC (× 106cfu/g) 2個水平。共設6個處理，每個處理重復12次，單株為一個重復，總計72株香蕉。

1.3 試驗方法

1.3.1 病菌接種方法 2013年10月18日，將事先準備好的孢子濃度為 × 107cfu/mL的香蕉枯萎病病菌原液用注射器吸取50 mL直接注入接種處理香蕉假莖周圍的基質(zhì)土中 (每克干土接種1 × 106cfu/g的FOC)，不接種處理的香蕉則用50 mL的清水代替。1.3.2 土壤理化性質(zhì)的測定 土壤有機質(zhì)用重鉻酸鉀容量法，土壤速效氮采用0.01 mol/L的CaCl2浸提—連續(xù)流動分析儀 (AA3) 測定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮；土壤速效磷采用NH4F-HCl浸提—鉬銻抗比色法測定；土壤速效鉀用1 mol/L的NH4OAC浸提—火焰光度法測定[13-14]。

1.3.3 香蕉病情統(tǒng)計及生物量測定 香蕉苗于2013年10月4日移栽至營養(yǎng)缽中，移苗后65天，即第8次澆灌肥后，接種FOC處理的香蕉明顯發(fā)病。此時調(diào)查統(tǒng)計香蕉染病率及病情指數(shù)；并收獲香蕉植株樣品，觀察球莖危害程度，分離驗證其為香蕉枯萎病病征[15]，測定植株生物量。

香蕉生物量的測定：收獲香蕉時將其地上部和根分開采樣，葉片用濕紗布輕輕擦拭，根用去離子水洗凈后用吸水紙吸干，先測定鮮重，殺青 (105℃，30 min) 后75℃烘干至恒重，再測定干重。

香蕉枯萎病發(fā)病率 (%)[16]= 染病植株總數(shù)/(染病植株總數(shù)+健康植株總數(shù)) × 100；

病情指數(shù) (%) = ∑(各級病株數(shù) × 該級級數(shù)值)/(總株數(shù) × 最高級級數(shù)值) × 100。

1.3.4 土壤微生物數(shù)種群數(shù)量的測定 在2013年12月8日收獲香蕉時，同時采集土壤樣品，每個處理12個重復中的基質(zhì)土混合保存在無菌塑封袋中，快速帶回實驗室，去除石塊和植物根系，過2 mm篩后混合均勻，用四分法將其分成3份，放入4℃冰箱保存，用于測定土壤微生物種群數(shù)量及功能多樣性。

測定土壤微生物的數(shù)量采用微生物平板計數(shù)法。香蕉尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基的配制參考文獻[17]。細菌、真菌、放線菌分別采用LB、孟加拉紅、高氏培養(yǎng)基[18-19]。

1.3.5 土壤微生物群落多樣性的測定

1) Biolog-ECO實驗方法：Biolog技術通過分布于96孔中的碳源底物來分析評價土壤微生物生理代謝特征。本研究采用有31種碳源的生態(tài)板 (Biolog-ECO) 分析微生物群落的代謝特征，即功能多樣性[20]。ECO板接種液的制備采用Classen等的方法[21]。

2) 數(shù)據(jù)測定分析：土壤微生物利用碳源的整體能力和活性，用孔的平均顏色變化率 (average well color development，AWCD) 表示[22]。

AWCD = ∑ (Ci - R)/n式中: Ci為每個有培養(yǎng)基孔的光密度值; R 為對照孔的光密度值; n為培養(yǎng)基碳源種類，本研究為31。

豐富度 (Richness) 是指被利用碳源的總數(shù)目，為每孔中 (C-R) 值大于0.25的孔數(shù)[23]。

Shannon-Wiener指數(shù)又稱多樣性指數(shù) (H')。

H' = -∑ (Pi·lnPi)

式中：Pi為有培養(yǎng)基的孔和對照孔的光密度值差與整板總差的比值，即Pi= (Ci- R)/∑ (Ci-R)[24]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 用Excel 2007和SPSS 15. 0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 肥料對香蕉枯萎病發(fā)生的影響

接種香蕉尖孢鐮刀菌51天后，不接種處理的香蕉沒有發(fā)現(xiàn)染病情況，接種處理的香蕉明顯發(fā)病，表明接種香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌是導致香蕉染病的根本原因。圖1為在接種尖孢鐮刀菌下，三個肥料處理的香蕉枯萎病發(fā)病統(tǒng)計結果。由圖1可見，香蕉的染病率、病情指數(shù)隨著肥料pH的升高而明顯降低，與酸性肥料處理相比，中性肥料處理的香蕉染病率和病情指數(shù)分別降低了21和6個百分點，堿性肥料分別降低了38和16個百分點。堿性肥料與酸性肥料的香蕉染病率和病情指數(shù)差異均達顯著水平。

圖1 施用pH不同的肥料對香蕉枯萎病發(fā)生的影響Fig. 1 Effect of fertilizers with different pH values on wilt infection and disease index of Fusarium wilt in banana plants

2.2 肥料和尖孢鐮刀菌對香蕉生物量的影響

所有香蕉整株干重、根部干重的統(tǒng)計結果如圖2所示。不接種尖孢鐮刀菌處理的香蕉根部和整株干重均明顯大于接種處理的，說明FOC是導致香蕉染病、嚴重影響香蕉正常生長的重要原因。圖2結果還表明，不接種尖孢鐮刀菌，三種肥料對香蕉根部和整株生物量影響不顯著。在接種尖孢鐮刀菌條件下，堿性肥料處理的香蕉地上部整株干重分別比中性和酸性肥料處理顯著增加15%和23%，香蕉根部干重在三種肥料處理間差異不顯著?？梢娫诓唤臃NFOC情況下，三種pH值的肥料不會明顯影響香蕉生物量的積累；當接種FOC時，堿性肥料相比中性和酸性肥料能顯著增加香蕉地上部生物量的積累，而對香蕉根部生物量積累影響不顯著。

圖2 接種和不接種尖孢鐮刀菌香蕉施用三種肥料的生物量Fig. 2 Biomass of banana applied with the three fertilizers under inoculated or without inoculated FOC

2.3 肥料和尖孢鐮刀菌對土壤微生物數(shù)量的影響

由表1可見，隨著肥料pH的升高，土壤中FOC和真菌種群數(shù)量減少，放線菌數(shù)量沒有顯著變化。在接種條件下，堿性肥料處理的FOC和真菌數(shù)量顯著小于中性肥料和酸性肥料處理的，中性肥料顯著小于酸性肥料處理的。堿性肥料處理的土壤FOC和真菌種群數(shù)量分別比酸性肥料處理的減少了60%和51%。在不接種FOC條件下，隨著肥料pH值的升高，F(xiàn)OC和真菌數(shù)量沒有明顯變化。結果還表明，施用堿性肥料相比酸性肥料土壤中細菌和放線菌的數(shù)量明顯增多。不接種FOC，堿性肥料處理的土壤放線菌和細菌數(shù)量顯著大于酸性和中性肥料處理的，其放線菌和細菌數(shù)量分別是酸性肥料的1.42和1.69倍。接種FOC后，堿性肥料和中性肥料處理的細菌數(shù)量顯著大于酸性肥料處理的，堿性肥料處理的細菌數(shù)量是酸性肥料的2.25倍。

表1結果還表明，接種和不接種FOC，土壤中FOC、真菌和細菌數(shù)量差異顯著，放線菌數(shù)量則沒有顯著差異。接種處理，土壤FOC和真菌數(shù)量顯著大于不接種處理的，細菌數(shù)量則顯著小于不接種處理的。

2.4 肥料對土壤微生物活性及多樣性的影響

2.4.1 肥料對土壤微生物總體活性的影響 AWCD可以反映土壤微生物群落的總體活性及對碳源的利用程度。培養(yǎng)期內(nèi)AWCD隨培養(yǎng)時間的延長呈“S”型曲線 (圖3)，24 h以內(nèi)土壤微生物活性較低，且增加緩慢，之后AWCD隨著培養(yǎng)時間延長迅速增大。24～72 h時AWCD值增加最快，72 h到96 h時3種肥料處理的AWCD值差異達到最大。從96 h開始，3種肥料處理利用總碳源趨于平穩(wěn)。從整個增長曲線分析發(fā)現(xiàn)，不接種FOC，堿性和中性肥料處理的微生物總活性大于酸性肥料處理，在72 h和96 h時差異顯著。接種FOC，堿性肥料的微生物利用碳源程度大于中性和酸性肥料，在72h時堿性肥料與酸性肥料間差異顯著，在96 h時堿性肥料與中性和酸性肥料差異均達顯著水平。此結果說明堿性肥料在接種和不接種情況下，較酸性肥料有利于提高土壤微生物的總碳源利用率及活性。2.4.2 肥料對土壤微生物多樣性的影響 由圖3結果可以看出，當培養(yǎng)到72 h時，三種肥料處理間微生物對碳源的利用差異達到最大，因此本文計算分析72 h時三種肥料處理微生物的豐富度 (Richness) 和多樣性指數(shù) (Shannon)。如表2所示，不接種FOC處理，三種肥料處理間的Richness和Shannon-Wiener指數(shù)沒有顯著差異。接種FOC處理，隨著肥料pH值的升高，不同處理的Richness和Shannon-Wiener指數(shù)增大，堿性肥料和酸性肥料間差異達顯著水平。此試驗結果說明，在不接種情況下，不同pH的肥料對土壤微生物多樣性影響不明顯，而在接種FOC情況下，肥料的pH值對微生物的多樣性影響顯著，堿性肥料較酸性肥料可以顯著地提高土壤微生物多樣性。

表1 肥料和FOC對土壤微生物數(shù)量的影響 (× 103 cfu/g)Table 1 Effects of the fertilizers and FOC on the soil microbial population

圖3 各處理AWCD值隨培養(yǎng)時間的變化Fig. 3 AWCD variation of total carbon sources with cultivation time prolonged

表2 肥料對土壤微生物多樣性的影響Table 2 Effect of the fertilizers on diversity of soil microbial communities

3 討論

本研究是在長期大量施用化肥導致土壤酸化、香蕉枯萎病加劇，而利用石灰調(diào)節(jié)發(fā)病蕉園土壤酸度并配合化肥防控香蕉枯萎病研究成果的基礎上[25]，針對農(nóng)田不宜連年施用石灰以及長期施用石灰導致土壤板結、耕性變差等問題，提出了堿性肥料的研究思路，研發(fā)了堿性氮磷鉀復合肥，并以此為供試肥料研究其對土壤微生物多樣性及香蕉枯萎病發(fā)生的影響。

3.1 肥料對土壤微生物種群數(shù)量的影響

引起香蕉枯萎病的是一種真菌類土傳病菌即尖孢鐮刀菌 (FOC)，和多數(shù)微生物一樣，其生命活動的生理生化反應與體內(nèi)外微環(huán)境的pH值有密切聯(lián)系[26]。試驗結果表明，接種時，隨著肥料pH的升高，土壤中FOC和真菌種群數(shù)量明顯減少。其原因在于FOC和其它真菌一樣喜好在酸性條件下生長，易在 pH值6以下的酸性砂質(zhì)或砂壤土中發(fā)作[27]。定期施用堿性肥料，土壤中的堿性環(huán)境對FOC的生長和萌發(fā)產(chǎn)生了抑制作用，因此其數(shù)量顯著減少[10]；而不接種時，隨著肥料pH值的升高，F(xiàn)OC和真菌數(shù)量并沒有明顯變化。這是因為不接種的土壤中存在極少量的 FOC，因此其 FOC 和真菌數(shù)量顯著小于接種處理，當 FOC 和真菌數(shù)量越小，不同 pH 值肥料處理間的 FOC 和真菌數(shù)量差異越不顯著。結果還表明，堿性肥料相比酸性肥料能提高土壤中細菌和放線菌的數(shù)量。這是因為放線菌和細菌是喜堿性環(huán)境生長的微生物，定期施用堿性肥料后，土壤中的微堿性環(huán)境更有利于細菌和放線菌的活動和繁殖[28]，因此其數(shù)量增大。

3.2 肥料對土壤微生物活性和多樣性的影響

土壤微生物種群數(shù)量的變化，必然會影響土壤微生物的總活性和多樣性[29]。處理間的AWCD結果表明，堿性肥料處理的AWCD增長曲線大于酸性肥料處理，即堿性肥料處理微生物的總活性大于酸性肥料處理。這是因為堿性肥料施用于酸性土壤后，改變了土壤原有微生物的酸堿環(huán)境，土壤中數(shù)量最多的放線菌和細菌數(shù)量增大，微生物總數(shù)增大，微生物對碳源的利用率隨之增大，因此土壤微生物的總體活性增大[30]。微生物多樣性的分析結果表明，接種時，堿性肥料處理的Richness和Shannon-Wiener顯著大于酸性肥料處理的。而不接種時，三種肥料處理間的Richness和Shannon-Wienerr指數(shù)沒有顯著差異。此結果可能是因為在接種條件下，F(xiàn)OC為主要優(yōu)勢種群，其必然會和其它種群微生物競爭生長所需的碳源等養(yǎng)分生境，從而引起其它微生物生長所需養(yǎng)分及空間不足。也可能是因為FOC的大量存在產(chǎn)生了某種物質(zhì)抑制其它微生物的生長[31]。土壤中施用堿性肥料時，土壤微生物所處的酸堿環(huán)境改變抑制了FOC的生長和繁殖，同時也更有利于放線菌和細菌的活動和生長[10]，因此施用不同pH的肥料，在接種條件下，比不接種條件下對微生物種群數(shù)量的影響更明顯。微生物數(shù)量的變化，尤其是施用堿性肥料后放線菌和細菌數(shù)量的顯著增加，是土壤微生物多樣性顯著提高的主要原因[32]。

3.3 肥料對香蕉枯萎病發(fā)生和生物量積累的影響

試驗結果表明，接種時，施用堿性肥料相比酸性肥料可以有效防控香蕉枯萎病的發(fā)生。一方面原因是施用堿性肥料后，土壤酸堿環(huán)境的變化抑制了FOC的生長，且其數(shù)量顯著減少，F(xiàn)OC數(shù)量的多少直接影響香蕉枯萎病的危害程度[33]；一方面是因為土壤中細菌等有益微生物的數(shù)量顯著增加，有研究表明某些香蕉枯萎病拮抗細菌和放線菌可以抑制FOC的生長，有助于防控香蕉枯萎病的發(fā)生[34]；另一方面是因為施用堿性肥料可以有效地提高土壤微生物多樣性，豐富的微生物多樣性則可以有效地抑制香蕉枯萎病的發(fā)生[35]。

堿性肥料較酸性肥料可以更有效地促進香蕉健康生長，積累更多的生物量。主要原因是因為土壤微生物在土壤養(yǎng)分轉化、有機質(zhì)的分解等方面起著重要的作用，土壤生態(tài)系統(tǒng)中各微生物群落數(shù)量與活性的提高有助于高肥力土壤的形成[12]。本試驗在接種FOC的土壤中施用堿性肥料后，土壤微生物的數(shù)量和活性提高，土壤的肥力也隨之提高，有助于香蕉吸收養(yǎng)分及生物量的積累。另一方面，改良土壤酸性環(huán)境是提高土壤土著微生物數(shù)量和活性的有效方法，也是防控香蕉枯萎病發(fā)生的有效方法[36]。施用堿性肥料后，香蕉枯萎病得到有效防控，減輕了FOC對香蕉的危害程度，促進了香蕉的健康生長，積累更多生物量。

4 結論

1) 肥料酸堿度 (pH值) 顯著影響土壤微生物種群數(shù)量。接種FOC條件下，隨著肥料pH值的升高，土壤中FOC和真菌數(shù)量顯著減少，細菌數(shù)量顯著增加。

2) pH值為8.0的堿性肥料能有效地提高土壤微生物總活性及多樣性。接種FOC條件下，堿性肥料處理的土壤微生物總活性和多樣性顯著大于酸性肥料處理。

3) 施用堿性肥料可以有效防控香蕉枯萎病的發(fā)生，降低香蕉的染病率和病情指數(shù)的主要原因是堿性肥料可以抑制FOC和真菌的生長和繁殖，而有利于細菌和放線菌等有益微生物的繁殖，有效地提高了土壤微生物的多樣性。

4) 在接種FOC條件下，相比酸性肥料，pH為8.0的堿性肥料可以有效促進香蕉的健康生長及生物量的積累。

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