貴州苗藥虎耳草及近緣種基于ITS2序列的鑒定研究

鄭春輝，楊永敏，吳春貴，梁凱乾，田曉紅，魏妮娜

(遵義醫(yī)學(xué)院 珠海校區(qū)生物工程系，廣東 珠海 519041)

虎耳草(SaxifragastoloniferaCurtis)，別名：老虎耳、佛耳草等，屬于虎耳草目，虎耳草科，虎耳草屬。其是貴州省重要的民族苗藥藥材，具有保肝、抗炎、鎮(zhèn)咳等功效[1]，其含有巖白菜素、貝格寧、原兒茶酸、沒(méi)食子酸和槲皮素等主要成分[2]。研究表明虎耳草不僅具有抗腫瘤活性[3]，還具有抗菌、抗氧化活性[4]，在貴州民間廣泛用于治療濕疹、中耳炎、痔瘡腫痛等疾病[5-6]，得到了醫(yī)生和患者的廣泛認(rèn)同?；⒍菰谖覈?guó)多個(gè)地區(qū)均有生長(zhǎng)，但是品質(zhì)卻參差不齊。有研究表明，貴州各地虎耳草藥材中巖白菜素含量在0.4%左右，遠(yuǎn)高于《貴州省中藥材、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的最低含量限度0.080%，而且沒(méi)食子酸的平均含量為0.121%，虎耳草的質(zhì)量較好[7]。一直以來(lái)，虎耳草原材料主要依靠野生資源，隨著需求量增加，野生虎耳草產(chǎn)量已不能滿足市場(chǎng)的需求，從而導(dǎo)致在收購(gòu)時(shí)出現(xiàn)品種混雜情況，嚴(yán)重影響到了藥材的質(zhì)量穩(wěn)定和臨床用藥的安全。

過(guò)去常用的藥材性狀鑒定方法和理化鑒定方法等傳統(tǒng)的手段在操作過(guò)程中，要么可靠性差，要么操作繁瑣。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，多種分子標(biāo)記技術(shù)，如內(nèi)部簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(inter simple sequence repeat,ISSR)[8]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (amplified fragment length polymorphism,AFLP)[9]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD )[10]和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (inter nal transcribed spacer,ITS)[11]等均被運(yùn)用于藥用植物的鑒定研究。其中ITS 序列分析技術(shù)憑借方便、可靠和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)受到人們的推崇和關(guān)注[12]。ITS序列是rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，分為ITS1和ITS2，其作為非編碼區(qū)，承受自然選擇的壓力小，長(zhǎng)度雖然較為保守，但核苷酸序列的變化較大，可以為研究提供較為詳盡的遺傳學(xué)信息。DNA條形碼技術(shù)是Hebert在2003年通過(guò)一段或幾段很短通用的標(biāo)準(zhǔn)目的基因DNA序列，對(duì)物種的分析及鑒定的一門技術(shù)[13]。現(xiàn)已成為鑒定生物界發(fā)展最快速的研究方向之一[14-16]。DNA條形碼不僅準(zhǔn)確性高，而且操作簡(jiǎn)單快速高效，同時(shí)可利用信息平臺(tái)和互聯(lián)網(wǎng)實(shí)現(xiàn)統(tǒng)一管理和共享[17]。中國(guó)學(xué)者首次提出將ITS2序列作為藥用植物標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，并建立了以ITS2序列為主的藥用植物類中藥材DNA條形碼鑒定體系。

本實(shí)驗(yàn)采集貴州苗藥虎耳草為樣本，提取總DNA，通過(guò)PCR技術(shù)和測(cè)序技術(shù)獲得虎耳草的ITS2序列，分析虎耳草及其近緣種序列，為虎耳草藥材的鑒定提供一個(gè)簡(jiǎn)單快速無(wú)誤的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 苗藥虎耳草均采集于貴州省，所有采集的樣品虎耳草藥材都是來(lái)自經(jīng)硅膠快速干燥的新鮮葉子，共6份樣本，其余的序列在GenBank中下載(見(jiàn)表1)。

表1樣品的采集來(lái)源

樣品名稱物種登陸號(hào)采集地點(diǎn)采集類型虎耳草1號(hào)SaxifragastoloniferaKY425697貴州省思南縣熬家溝組野生虎耳草2號(hào)SaxifragastoloniferaKY425698貴州省思南縣巖石河村野生虎耳草3號(hào)SaxifragastoloniferaKY425699貴州省思南縣巖石河村野生虎耳草4號(hào)SaxifragastoloniferaKY425700貴州省黔東南浪洞鎮(zhèn)后寨村野生虎耳草5號(hào)SaxifragastoloniferaKY425704貴州省赫章縣興發(fā)苗族鄉(xiāng)野生虎耳草6號(hào)SaxifragastoloniferaKY425705貴州省凱里市又莊小區(qū)A種植小虎耳草SaxifragastoloniferasmallKC004032.1湖南懷化Genbank下載沼澤虎耳草SaxifragahirsutaLM654415.1德國(guó)馬丁大學(xué)Genbank下載喜馬拉雅虎耳草SaxifragabrunoniLN812370.1喜馬拉雅Genbank下載西藏虎耳草SaxifragatibeticaLN812551.1西藏Genbank下載青藏虎耳草SaxifragaprzewalskiiLN812508.1青藏Genbank下載爪瓣虎耳草SaxifragaunguiculataLN812561.1-Genbank下載金星虎耳草Saxifragastella-aureavarLN812539.1-Genbank下載理塘虎耳草Saxifraga.litangensisLN812471.1-Genbank下載小短尖虎耳草SaxifragamucronulataLN812484.1-Genbank下載紅毛虎耳草SaxifragarufescensLN812521.1-Genbank下載鏡葉虎耳草SaxifragafortuneivarLN81248.1-Genbank下載薩維爾虎耳草SaxifragatayloriiKF196351.1-Genbank下載狹葉虎耳草SaxifragaangustataLN812351.1-Genbank下載

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 植物DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，瓊脂糖購(gòu)自北京金鑫天佑生物科技有限公司，6×DNA上樣緩沖液、GoldViewTM、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker購(gòu)自北京莊萌國(guó)際生物基因科技有限公司，ITS 序列擴(kuò)增引物購(gòu)自北京六合華大基因科技股份有限公司，引物4rev、引物5afwd和Pfu酶購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，相應(yīng)操作按照說(shuō)明書上進(jìn)行。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 瓊脂糖水平電泳儀和凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)，PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)，MeastroNano Drop微量分光光度計(jì)(Novazym Distribution)。

1.2 方法

1.2.1 樣品虎耳草的采集及其總DNA提取 采集新鮮虎耳草，葉片用酒精擦拭風(fēng)干，用硅膠密封干燥。取干燥后的樣品用液氮研磨成粉末狀，稱取40 mg加到1.5 mL的離心管中，再利用天根生化科技有限公司植物DNA提取試劑盒提取總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和測(cè)序 配制反應(yīng)體系為25 μL，其中2Pfu master mix為12.5 μL，4rev為1 μL，5afwd為1 μL，DNA模板為4 μL，ddH2O為6.5 μL。配制體系所用到的引物為通用引物(見(jiàn)表2)，PCR儀循環(huán)程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃復(fù)性1.5 min，72 ℃延伸7 min，共計(jì)30個(gè)循環(huán)。

表2 DNA條形碼引物

序列名稱引物名稱引物序列ITS5afwd(上游)5'-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3'4rev(下游) 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

PCR擴(kuò)增完成后，取2 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察膠上是否有預(yù)計(jì)的條帶，將有條帶的PCR產(chǎn)物送去廣州生工生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析及提交到GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù) 獲得測(cè)序結(jié)果后，利用DNA MAN軟件進(jìn)行序列的拼接，把低質(zhì)量序列和引物部分去除，利用Sequin軟件把所拼接好的虎耳草序列的正確信息輸入到該軟件中，得到sqn文件。再以附件的形式發(fā)送到GenBank的郵箱中，申請(qǐng)序列登陸號(hào)。后續(xù)將所測(cè)序列用MEGA5.0分析對(duì)比，計(jì)算出種內(nèi)和種間最大遺傳距離K2P，建立NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用ITS的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)(見(jiàn)圖1)，結(jié)果所有樣品均得到ITS片段擴(kuò)增產(chǎn)物，片段大小約在750 bp，PCR產(chǎn)物用凝膠電泳檢測(cè)有單一清晰條帶，無(wú)拖尾現(xiàn)象，可送去測(cè)序公司進(jìn)行PAGE純化和雙向測(cè)序。

Marker：DL2000 Marker；1～6：虎耳草1～6號(hào)。圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜

2.2 虎耳草ITS堿基序列及片段的特征結(jié)果 經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，6個(gè)樣品虎耳草ITS序列堿基完全相同，ITS總長(zhǎng)度為680 bp，ITS1長(zhǎng)度為285 bp，ITS2的長(zhǎng)度為236 bp，序列堿基詳見(jiàn)圖2。

虎耳草近緣種的ITS2片段長(zhǎng)度范圍為236～243 bp，GC含量范圍為48.1%～58.1%。由于6個(gè)樣品虎耳草的ITS序列堿基完全相同，故所得到的ITS2序列也就一樣，長(zhǎng)度均為236 bp，GC含量均為50.6%；貴州苗藥虎耳草的GC含量與同種小虎耳草的GC含量一致，說(shuō)明種內(nèi)無(wú)差異，與其它近緣種的ITS2片段在序列長(zhǎng)度和GC含量相比，均有差異(見(jiàn)表3)。

6個(gè)貴州苗藥虎耳草樣品與近緣種ITS2序列進(jìn)行種類種間變異位點(diǎn)分析(見(jiàn)圖3)，共有124個(gè)變異位點(diǎn)，其中虎耳草與同種小虎耳草之間無(wú)變異差異。

2.3 虎耳草及其近緣種ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較 利用ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到虎耳草及近緣種的二級(jí)結(jié)構(gòu)，由結(jié)果(見(jiàn)圖4)可以看出，貴州虎耳草的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)均由一個(gè)以啞鈴型中心環(huán)及4個(gè)螺旋區(qū)所構(gòu)成，而近緣種的二級(jí)結(jié)構(gòu)由一個(gè)中心環(huán)螺旋區(qū)構(gòu)成，狹葉虎耳草Saxifragaangustata、鏡葉虎耳草Saxifragafortuneivar等臂環(huán)的大小都有所不同，每個(gè)螺旋區(qū)的角度也有所不同；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ上徑環(huán)大小、數(shù)目、臂環(huán)角度、位置均有差異，結(jié)果表明：運(yùn)用ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)可以直觀地將虎耳草及其近緣種區(qū)分開來(lái)。

圖2 苗藥虎耳草ITS堿基序列

表3 ITS2序列特征

物種名長(zhǎng)度(bp)A(bp)T(bp)C(bp)G(bp)CG含量(%)Saxifragastolonifera1^62365757635950.6Saxifragastoloniferasmall2365757635950.6Saxifragahirsuta2385150706757.6Saxifragaangustata2394753697058.1Saxifragamucronulata2384853686957.6Saxifragabrunonis2394856676856.5Saxifragaunguiculata2394659676655.6Saxifragastella-aureavar2394657666956.4Saxifragalitangensis2394857656855.6Saxifragatibetica2394957656855.6Saxifragaprzewalskii2394957656755.2Saxifragafortuneivar2385169556349.7Saxifragataylorii2435373576048.1Saxifragarufescens2416063595948.9

圖4 虎耳草及其近緣種ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4 建立虎耳草及其近緣種ITS2序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹 對(duì)所采集的虎耳草與GenBank中下載的13條虎耳草的近緣種ITS2序列，構(gòu)建虎耳草的NJ發(fā)育樹。構(gòu)建出來(lái)的發(fā)育樹結(jié)果(見(jiàn)圖5)：虎耳草屬物種主要聚為兩大枝，其中貴州苗藥虎耳草Saxifragastolonifera和小虎耳草Saxifragastoloniferasmall單獨(dú)聚為一小枝，與狹葉虎耳草Saxifragaangustata、喜馬拉雅虎耳草Saxifragabrunonis、理塘虎耳草Saxifragalitangensis、沼澤虎草Saxifragahirsuta等近緣種聚為一大枝；而沼澤虎草Saxifragahirsuta與虎耳草Saxifragastolonifera的親緣關(guān)系比狹葉虎耳草Saxifragaangustata、喜馬拉雅虎耳草Saxifragabrunonis等的親緣關(guān)系更近。貴州苗藥虎耳草Saxifragastolonifera和近緣種呈現(xiàn)出明顯的單系性，可以很直觀地區(qū)分開。由此可以看出，ITS2序列可以準(zhǔn)確有效地鑒定虎耳草及近緣種。

圖5 虎耳草及其近緣種ITS2序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

虎耳草植物在貴州分布相對(duì)廣泛，而且貴州虎耳草的藥用成分含量比較高，品質(zhì)較好。近幾年隨著濫采濫挖，導(dǎo)致野生藥材資源銳減，并且在市場(chǎng)上出現(xiàn)以次充好等現(xiàn)象，這些對(duì)臨床用藥的有效性和安全性會(huì)造成很大的隱患。雖然傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定、化學(xué)鑒定等方法在藥材的鑒別中發(fā)揮了一定的作用，但對(duì)于鑒定外觀形態(tài)相似的近緣種藥材，存在很大困難。而DNA序列信息可以區(qū)別發(fā)生變異的物種，通過(guò)建立一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，可快速有效鑒定大量的標(biāo)本，物種身份通過(guò)實(shí)驗(yàn)技術(shù)鑒定，不需要經(jīng)驗(yàn)豐富的專家，這些均體現(xiàn)了DNA條形碼具有高準(zhǔn)確、高效率、且不受人為因素的影響等優(yōu)點(diǎn)。有研究人員成功利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)來(lái)源不同產(chǎn)地藥材臭蒿[18]、艾納香[19]、白及[20]、柴胡[21]、板南根[22]、雞骨草[23]等藥材進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果表明DNA條形碼技術(shù)用于藥材鑒定已經(jīng)相當(dāng)成熟。因此，DNA條形碼技術(shù)在藥材分類、標(biāo)準(zhǔn)制定、藥材流通和市場(chǎng)管理等實(shí)際應(yīng)用中具有重要的價(jià)值。

近年來(lái)，ITS2序列在DNA條形碼技術(shù)研究鑒定和生物分類學(xué)中比較熱門[24]，該研究在藥材植物的鑒定技術(shù)中的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性是當(dāng)前的重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，ITS2序列在植物的研究中，擴(kuò)增率高和物種間鑒定效果強(qiáng)，同時(shí)ITS2序列還具有鑒定條形碼序列的潛力[25]。本研究在貴州采集6份不同地點(diǎn)的虎耳草基源植物利用DNA條形碼獲得ITS2序列，結(jié)果表明，黔東南地區(qū)和黔西地區(qū)采集的虎耳草ITS2序列無(wú)堿基差異，6個(gè)采自貴州不同地方的虎耳草樣品屬于同一個(gè)種的虎耳草。通過(guò)變異位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)貴州苗藥虎耳草Saxifragastolonifera與小虎耳草Saxifragastoloniferasmall之間無(wú)變異位點(diǎn)，說(shuō)明種內(nèi)無(wú)變異，屬于同一個(gè)種下的不同變種，需要進(jìn)一步研究。苗藥虎耳草與其他近緣種之間存在相應(yīng)的變異位點(diǎn)；并且與其近緣種ITS2序列的長(zhǎng)度和GC含量均存在差異。在比較苗藥虎耳草及其近緣種的ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，苗藥虎耳草二級(jí)結(jié)構(gòu)的中心環(huán)呈啞鈴型，近緣種的二級(jí)結(jié)構(gòu)的中心環(huán)呈橢圓形或圓形，可以很直觀地將虎耳草與近緣種區(qū)分開來(lái)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以ITS2作為DNA條形碼對(duì)貴州虎耳草和其近源種的鑒定研究，不僅準(zhǔn)確性高，而且操作快速簡(jiǎn)單。本研究不僅為虎耳草的分類以及該藥材的質(zhì)量控制和近緣種混偽品鑒定提供科學(xué)依據(jù)，還為虎耳草臨床用藥的安全提供了保障，同時(shí)將獲得的貴州苗藥虎耳草的ITS2序列，成功上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，得到登錄號(hào)，實(shí)現(xiàn)資源共享。但是該研究也還存在不足之處，該方法只能用于貴州虎耳草和其近緣種的鑒定，無(wú)法對(duì)貴州不同地區(qū)的虎耳草和小虎耳草進(jìn)行更細(xì)的分類和其藥理活性進(jìn)行鑒別，后續(xù)將結(jié)合RAPD技術(shù)和理化成分分析，進(jìn)行更進(jìn)一步研究。

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