反相高效液相色譜法測定褐藻中巖藻黃素的含量*

劉小芳 蔣永毅 侯欽帥,3 苗鈞魁 冷凱良①

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 山東信諾檢測技術(shù)有限公司 青島 266101；3. 青島大學(xué)藥學(xué)院 青島 266021)

巖藻黃素(Fucoxanthin)亦稱巖藻黃質(zhì)、褐藻素，化學(xué)名為 3-(乙酰氧基)-6′,7′-二脫氫-5,6-環(huán)氧-5,5′,6,6′,7,8-六氫-3,5′-二氫基-8-氧代-β,β-胡蘿卜素，分子式為C42H58O6，分子量為658.91，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。巖藻黃素是褐藻、硅藻等海洋藻類和無脊椎動物所含有的一種重要的類胡蘿卜素，是使褐藻類呈現(xiàn)出褐色的物質(zhì)，也是硅藻類植物的指標(biāo)性色素(Yaoet al,2006)。褐藻中巖藻黃素的含量達(dá)到自然界中類胡蘿卜素總量的10%以上。世界海洋中，每年海藻巖藻黃素的產(chǎn)量可達(dá) 6.8×106t，資源量十分豐富(嚴(yán)小軍等,2001; 汪曙暉等, 2010)。巖藻黃素具有良好的抑制肥胖(Maedaet al, 2005;Miyashitaet al, 2011)、調(diào)節(jié)糖代謝(Maedaet al,2007)、抗腫瘤(張文源等, 2015; Wanget al, 2012)、抑制血管新生、抑制炎癥(Shiratoriet al, 2005)的作用，在海藻保健食品及醫(yī)藥制品開發(fā)領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。受加工技術(shù)限制，國內(nèi)應(yīng)用巖藻黃素的產(chǎn)品極少，而以其為功能因子的膳食補(bǔ)充劑在美國、韓國和日本等國早已上市。尋找最佳的巖藻黃素來源、加快相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)成為目前國內(nèi)海藻加工行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)。建立快速、準(zhǔn)確的海藻巖藻黃素色譜分析方法，對于保證行業(yè)健康發(fā)展、實(shí)現(xiàn)市場有效監(jiān)管和維護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益十分重要。

圖1 巖藻黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of fucoxanthin

巖藻黃素屬丙二烯型類胡蘿卜素，含有5,6-單環(huán)氧基、9個共軛雙鍵，還有羰基和羥基(張文源等, 2015;Wanget al, 2014)。這些特征性結(jié)構(gòu)的存在導(dǎo)致巖藻黃素極不穩(wěn)定，在強(qiáng)光或高溫條件下易被氧化和異構(gòu)化，從而發(fā)生降解(張文源等, 2015; Zhaoet al, 2014)。干制過程是海藻初級加工品及海藻化工生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不同干制過程對巖藻黃素的影響不同。確定加工生產(chǎn)過程中應(yīng)選取的最佳干制方式，對于最大限度地獲取海藻巖藻黃素資源具有指導(dǎo)意義。因此，本研究建立了基于 C18柱固相萃取前處理、RP-HPLC-DAD檢測的海藻中巖藻黃素定量分析方法，并采用該方法對新鮮及不同干制方式預(yù)處理的代表性褐藻中巖藻黃素含量進(jìn)行了檢測，以期為海藻巖藻黃素資源的合理開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮海帶(Saccharina japonica)及馬尾藻(Sargassumsp.)由山東尋山集團(tuán)提供，采集于2016年6月，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后貯藏于-20℃冰箱中備用；巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司；C18固相萃取柱購于天津博納艾杰爾科技有限公司；色譜純甲醇購于Burdick & Jackson公司；分析純甲醇購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 儀器設(shè)備

1260 InfinityⅡ型液相色譜系統(tǒng)(二極管陣列檢測器)(美國 Agilent公司)；ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6×150 mm, 5 μm)(美國 Agilent公司)；UV1102Ⅱ型紫外-可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；BAS224S-CW 型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SB-4200DTD型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；ZMQS50001型Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同干制方式褐藻樣品的制備 稱取1.00 kg新鮮褐藻樣品，粉碎，混合均勻后分成4等份：1份作為新鮮褐藻樣品；另3份分別采用自然晾干、烘干(45±3℃)、真空冷凍干燥3種方式進(jìn)行處理，待干燥至恒重后分別加入研磨機(jī)中粉碎，制備得到晾干褐藻、烘干褐藻、凍干褐藻樣品。

1.3.2 樣品前處理 稱取2.00 g樣品于棕色具塞三角瓶中，加入10 ml甲醇，超聲提取30 min，靜置后移取5 ml提取液，補(bǔ)加3 ml甲醇、2 ml水至提取液中(甲醇與水的體積比為4∶1)，得到10 ml樣品液。C18固相萃取柱經(jīng)10 ml甲醇、10 ml水活化處理后，將上述10 ml樣品液移至萃取柱進(jìn)行吸附，而后采用10 ml 80%甲醇溶液淋洗，棄淋洗液，最后采用20 ml 90%甲醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液至25 ml棕色容量瓶，定容，混勻，過0.45 μm微孔濾膜后供色譜分析用。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6×150 mm, 5 μm)；流動相A為水；流動相B為甲醇；梯度洗脫程序見表1；流速為0.7 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl，柱溫為35℃，檢測波長為450 nm；外標(biāo)法定量。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Tab.1 The gradient elution program of HPLC

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel 2013進(jìn)行處理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

本研究采用 C18柱固相萃取法進(jìn)行褐藻及其干制品中巖藻黃素的分離凈化，優(yōu)化了樣品提取效果，有效去除了其他脂質(zhì)成分對色譜檢測的影響。以巖藻黃素回收率為評價指標(biāo)，對洗脫溶劑中甲醇比例、洗脫液體積(圖2)進(jìn)行了選擇。結(jié)果顯示，洗脫液中甲醇濃度為60%～80%時，不能實(shí)現(xiàn)對吸附在C18柱上巖藻黃素的完全洗脫，當(dāng)甲醇濃度增加至90%時，巖藻黃素的洗脫回收率達(dá)到99.3%，因此，確定洗脫液選用90%甲醇溶液。由圖2可知，隨著洗脫液用量的增大，巖藻黃素回收率逐漸提高，當(dāng)洗脫體積達(dá)到20 ml時，巖藻黃素回收率達(dá)到 99.3%，繼續(xù)增大洗脫劑用量，巖藻黃素回收率不再有明顯上升，說明采用20 ml以上體積洗脫液可以實(shí)現(xiàn)巖藻黃素的理想回收。因此，最終確定采用20 ml 90%甲醇溶液進(jìn)行C18柱固相萃取洗脫。

圖2 C18柱固相萃取巖藻黃素洗脫曲線Fig. 2 C18-SPE elution curve of fucoxanthin

2.2 檢測波長的選擇

對巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品在200～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，吸收光譜如圖3所示。結(jié)果顯示，巖藻黃素在450 nm波長處具有最大吸收，因此，確定色譜檢測波長為450 nm。

圖3 巖藻黃素紫外-可見全波長掃描吸收光譜Fig. 3 The UV-Vis wavelength scanning absorption spectra of fucoxanthin standard

2.3 方法檢測限及線性范圍的確定

按儀器信噪比(S/N)為 3測定得到方法檢出限為0.03 mg/L。

分別以巖藻黃素的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、以對應(yīng)的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制巖藻黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：Y=38.46X+0.8899，R2=0.9999，線性區(qū)間為0.11～50 mg/L。在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，可以通過外標(biāo)法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。

2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，測定了加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。在100～600 mg/kg加標(biāo)濃度范圍內(nèi)，巖藻黃素的加標(biāo)回收率為 92.66%～109.06%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.46%～4.61%。本色譜方法的加標(biāo)回收效果良好，準(zhǔn)確度高，可用于褐藻樣品中巖藻黃素含量的測定。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The spike recoveries of fucoxanthin

2.5 新鮮及干制褐藻樣品中巖藻黃素含量的測定

對新鮮及不同干制方式處理的海帶和馬尾藻樣品中巖藻黃素的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果見圖4、表3。經(jīng)C18柱固相萃取洗脫凈化后，在確定的色譜條件下，巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間為10.223 min，海帶和馬尾藻樣品檢測基本無干擾，雜質(zhì)峰較少，可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量(圖4)。由表3可知，新鮮海帶中巖藻黃素含量(干基)為559.2 mg/kg，自然晾干、烘干和凍干海帶中巖藻黃素含量(干基)分別為204.5、205.9和322.4 mg/kg；新鮮馬尾藻中巖藻黃素含量(干基)為680.4 mg/kg，自然晾干、烘干和凍干馬尾藻中巖藻黃素含量(干基)分別為220.4、225.9和458.8 mg/kg。不同干制方式褐藻中巖藻黃素的含量明顯低于新鮮褐藻，其中，經(jīng)真空冷凍干燥處理后，褐藻巖藻黃素的保留率最高，自然晾干與烘干處理造成的巖藻黃素?fù)p失程度基本相同。

3 討論

目前，關(guān)于海藻樣品中巖藻黃素的含量研究已有報(bào)道，但大部分仍局限于采用分光光度法進(jìn)行測定(任丹丹等, 2011; 詹冬梅等, 2016; 秦云等, 2013)，采用色譜方法進(jìn)行巖藻黃素定量分析的報(bào)道相對較少。宮平等(2012)采用乙醇抽提-高效液相色譜法檢測海帶中巖藻黃素的含量，方法線性范圍為0.3125～10 mg/L，檢測限為0.01 mg/L。汪曙暉(2010)采用丙酮抽提-高效液相色譜法檢測硅藻中巖藻黃素的含量，方法線性范圍為7.2～144 mg/L，檢測限為0.72 mg/L。本實(shí)驗(yàn)方法采用甲醇抽提-C18柱固相萃取-高效液相色譜法檢測褐藻中巖藻黃素的含量，方法線性范圍為0.11～50 mg/L，檢測限為0.03 mg/L。對比可知，本檢測方法定量限更低，靈敏度更高，適合于海藻及其相關(guān)制品中低含量巖藻黃素的定量分析。本檢測方法改善了樣品的前處理方式，采用C18柱固相萃取法完成樣品巖藻黃素粗提物的凈化，液相色譜圖顯示該前處理方法明顯優(yōu)化了提取效果，有效去除了其他雜質(zhì)成分對巖藻黃素檢測的影響。經(jīng) C18柱固相萃取凈化后，采用甲醇與水作為流動相進(jìn)行梯度洗脫即可實(shí)現(xiàn)巖藻黃素與其他雜質(zhì)成分的分離，免除了緩沖鹽溶液、乙腈及其他有機(jī)試劑等的使用，簡化了色譜流動相的組成，減少了檢測過程中有毒試劑的使用。同時，本實(shí)驗(yàn)確定的 C18柱固相萃取洗脫條件也為后期海藻巖藻黃素的規(guī)?；蛛x制備提供了參考。

圖4 巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品(A)、鮮海帶(B)和鮮馬尾藻(C)反相高效液相分離圖譜Fig.4 The RP-HPLC spectrum of fucoxanthin standard (A),fresh kelp (B) and fresh sargassum (C)

采用建立的反相高效液相色譜法測定得到新鮮海帶和馬尾藻中巖藻黃素含量(干基)為 559.2 mg/kg和680.4 mg/kg，與他人的研究結(jié)果基本一致(任丹丹等, 2011; 詹冬梅等, 2016; 宮平等, 2012)。經(jīng)不同干燥方式處理后，2種褐藻中巖藻黃素均出現(xiàn)不同程度的損失：采用真空冷凍干燥法作為褐藻的干制方式，可以保留原料中約 55%～65%的巖藻黃素；而采用自然晾干法或烘干法作為褐藻的干制方式，僅能保留原料中約35%的巖藻黃素，這與巖藻黃素在強(qiáng)光或高溫條件下易被氧化和異構(gòu)化，從而發(fā)生降解有關(guān)(張文源等, 2015; Zhaoet al, 2014)。因此，在開發(fā)海藻巖藻黃素資源時，宜采用新鮮或凍干海藻作為原料，以提高巖藻黃素的得率。

表3 新鮮及干制褐藻樣品中巖藻黃素含量測定結(jié)果Tab.3 The fucoxanthin contents of the fresh and dried brown seaweed samples

4 結(jié)論

本研究確定了一種新的可用于海藻中巖藻黃素定性定量分析的反相高效液相色譜法。與現(xiàn)有的檢測方法相比，該方法采用C18柱固相萃取法進(jìn)行樣品巖藻黃素粗提物的凈化，明顯優(yōu)化了提取效果，色譜檢測梯度洗脫流動相也得到簡化；同時該方法還具有檢測限低、線性范圍寬、雜質(zhì)干擾小、回收率高等特點(diǎn)。

干制褐藻樣品中巖藻黃素的含量明顯低于新鮮褐藻，經(jīng)真空冷凍干燥處理后，褐藻巖藻黃素的保留率最高，自然晾干與烘干處理造成的巖藻黃素?fù)p失程度基本相同。在開發(fā)海藻巖藻黃素資源時，宜采用新鮮或凍干海藻作為原料，從而保證巖藻黃素的得率。本研究為后期海藻巖藻黃素資源的規(guī)?；_發(fā)提供了理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

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