微壓氧對(duì)大強(qiáng)度訓(xùn)練大鼠氧化應(yīng)激的影響

張 冉，趙 鵬

隨著世界競(jìng)技水平的提高，運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練強(qiáng)度也在不斷地增大，運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練后或比賽期間的恢復(fù)越來(lái)越受到關(guān)注。不充分的恢復(fù)不僅會(huì)導(dǎo)致疲勞、運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)下降，甚至還會(huì)增加運(yùn)動(dòng)損傷的可能性[1]。因此，實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練、比賽應(yīng)激以及恢復(fù)之間的適當(dāng)平衡對(duì)于提高運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)是非常重要的。

微壓氧療法 （Mild-pressure Hyperbaric Therapy，mHBT）是指吸入壓力在1～2絕對(duì)大氣壓（Absolute Atmosphere，ATA）之間、氧濃度大于 35%的環(huán)境氣體的過程[2]。近年來(lái)微壓氧在優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員中使用變得越來(lái)越流行，最近在普通大眾中已成為改善疲勞、增強(qiáng)整體健康、恢復(fù)運(yùn)動(dòng)相關(guān)損傷以及抗衰老的方式。但是對(duì)于微壓氧的治療效果以及機(jī)制的研究甚少。Kim等研究了微壓氧對(duì)氧化應(yīng)激及疲勞的影響[2]。所有參與者在微壓氧前后進(jìn)行指標(biāo)測(cè)評(píng)。結(jié)果活性氧代謝物（Reactive Oxygen Metabolites，ROMs）和疲勞類推視覺量表在微壓氧前后有顯著性差異，而生物抗氧化能力（Biological Antioxidant Potential，BAP）沒有顯著性差異。結(jié)果揭示微壓氧可以有效地減少氧化應(yīng)激，而主觀指標(biāo)的變化可能與微壓氧的安慰劑效果有關(guān)。因此，微壓氧是否能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后機(jī)體的恢復(fù)還有待于進(jìn)一步研究。

氧化應(yīng)激是指自由基的產(chǎn)生和清除之間不平衡，自由基的產(chǎn)生大于自由基的清除。為了保持體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除之間的平衡，身體的抗氧化系統(tǒng)被激活以保護(hù)細(xì)胞。但是當(dāng)抗氧化防御系統(tǒng)不夠強(qiáng)壯和有效消除加速產(chǎn)生的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）和 活 性 氮 （Reactive Nitrogen Species，RON）時(shí)，氧化應(yīng)激就會(huì)發(fā)生，而氧化應(yīng)激的發(fā)生會(huì)干擾細(xì)胞信號(hào)通路。長(zhǎng)久的氧化還原平衡的改變也會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)帶來(lái)?yè)p害，如核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)甚至是通過凋亡引起細(xì)胞死亡[3]。機(jī)體可以通過自身的抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)抵抗自由基造成的細(xì)胞損傷，主要包括酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)。酶促系統(tǒng)主要包括,超氧化物歧化酶（Super Oxide Dismutase，SOD），過 氧 化 氫 酶 （Catalase，CAT）,谷胱甘肽過氧化物酶 （GlutathionPeroxidase，GSH-PX）等。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠40只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK（京）2012-0001。 體重（230±7）g。 于 SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲水飲食，專人定期更換飼料和墊料，室溫23～25℃，相對(duì)濕度45%～55%，每天光照時(shí)間12 h。飼養(yǎng)室、用具等定期消毒滅菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和運(yùn)動(dòng)干預(yù)

大鼠購(gòu)入后進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，使大鼠適應(yīng)動(dòng)物房環(huán)境。3 d后所有的大鼠進(jìn)行7 d的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，訓(xùn)練方案為每天訓(xùn)練15 min，跑臺(tái)速度為15 m/min，跑臺(tái)坡度為0°。適應(yīng)性訓(xùn)練后，選取適應(yīng)跑臺(tái)訓(xùn)練的大鼠30只，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組 （Control，C）、大強(qiáng)度訓(xùn)練后自然恢復(fù)組（Quiet Rest after High Intensity Training，HQ）、大強(qiáng)度訓(xùn)練后微壓氧恢復(fù)組 （Mild-pressure Hyperbaric Therapy after High Intensity Traininng，HM），每組 10只。 大強(qiáng)度訓(xùn)練后HQ在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后自然恢復(fù)，大強(qiáng)度訓(xùn)練后HM組在大強(qiáng)度訓(xùn)練后放入微壓氧倉(cāng)恢復(fù)1 h。

采用Bedford訓(xùn)練方案，對(duì)HQ組和HM組大鼠進(jìn)行大強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練[4]。每天上午的8:00～12：00之間進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練周期為8周，每周訓(xùn)練5 d，每天60 min，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為 26.8 m/min，坡度為 10°（最大攝氧量約為81.00%±3.5）。在訓(xùn)練的開始先以15 m/min速度跑5 min，隨后在5 min內(nèi)逐漸增至26.8 m/min，維持直至訓(xùn)練結(jié)束。最后一次跑至力竭，記錄力竭時(shí)間。HM組每次訓(xùn)練結(jié)束后立即放入微壓氧倉(cāng) （型號(hào)：OBI-IF），購(gòu)自氧沐國(guó)際高新技術(shù)（北京）股份有限公司，恢復(fù)1 h。微壓氧倉(cāng)氧濃度為26%左右，壓強(qiáng)為3.6 PSI。力竭標(biāo)準(zhǔn)：（1）動(dòng)物跟不上預(yù)定的跑速，先后滯跑道后1/3處達(dá)6次以上，聲、光、電刺激驅(qū)趕均無(wú)效；（2）停止跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后俯臥位，呼吸深急、幅度大，神情倦怠、腹臥位跑、垂頭等，對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍，翻正反射消失。

1.3 取材

各運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)組大鼠均在運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)后恢復(fù)24 h取材。大鼠腹腔注射10%水合氯醛，按40mg/100g體重劑量注射麻醉。麻醉好后迅速剝離右側(cè)腓腸肌，用生理鹽水清洗、濾紙吸干后分為兩部分，其中一部分放在凍存管中保存于-80℃冰箱中，用于骨骼肌氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)，一部分放置于盛有4%多聚甲醛的廣口瓶中常溫保存，用于石蠟切片病理學(xué)檢查。

1.4 測(cè)試指標(biāo)及方法

1.4.1 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

MDA含量采用TBA法測(cè)定，SOD活性采用WST-1法，CAT的測(cè)定采用可見光法，GSH-PX的測(cè)定采用比色法。SOD活性使用酶標(biāo)儀 （賽默飛，Wellscan）檢測(cè)，其余使用分光光度計(jì)（Unico,7200）檢測(cè)。試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4.2 骨骼肌組織學(xué)制備

將固定好的大鼠腓腸肌依次經(jīng)脫水、組織透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、水化、蘇木素染色、分化、伊紅染色、脫水、透明、封片，制成HE染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察、攝取圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，每組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，力竭時(shí)間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，其他指標(biāo)采用單因素方差分析法比較組間差異，以P＜0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠的一般狀況

經(jīng)過8周的實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組大鼠神態(tài)安靜，狀態(tài)良好，飲食飲水正常，皮毛光亮整潔，反應(yīng)敏捷，眼睛有神；HQ組和HM組大鼠出現(xiàn)懶動(dòng)倦怠，飲食飲水減少，毛發(fā)無(wú)光澤，雙眼暗淡無(wú)光，個(gè)別大鼠出現(xiàn)便溏，自主活動(dòng)減少，反應(yīng)能力降低，這些表現(xiàn)以HQ組大鼠尤為明顯。

2.2 微壓氧對(duì)大鼠力竭時(shí)間的影響

運(yùn)動(dòng)耐力是評(píng)估抗疲勞效果的重要參數(shù)，運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間的長(zhǎng)短可以作為評(píng)估運(yùn)動(dòng)耐力和疲勞的指標(biāo)。由表1可見，HM組大鼠與HQ組大鼠比較，大鼠在跑臺(tái)上跑至力竭的時(shí)間有明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明微壓氧可以增強(qiáng)大鼠運(yùn)動(dòng)耐力和抗疲勞的效果。

表1 不同恢復(fù)方式大鼠力竭時(shí)間的比較（X±SD）Table I Comparison between the Time to Exhaustion of Rats Using Different Recovery Methods(X±SD）

2.3 微壓氧對(duì)大鼠腓腸肌中MDA含量及抗氧化酶活性的影響

2.3.1 微壓氧對(duì)丙二醛（MDA）含量的影響

MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的一個(gè)重要產(chǎn)物，是衡量體內(nèi)自由基代謝和機(jī)體受損程度的一個(gè)重要指標(biāo)。由表2可知，HQ組大鼠MDA含量顯著高于C（P＜0.05），HM組MDA含量低于HQ組，具有顯著性差異 （P＜0.05），而大強(qiáng)度訓(xùn)練后 HM 組大鼠MDA含量與C相比沒有顯著性差異，表明大強(qiáng)度訓(xùn)練可以引起MDA含量升高，而微壓氧可以減少M(fèi)DA含量，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

表2 各組大鼠腓腸肌中MDA含量及抗氧化酶活性測(cè)試結(jié)果（X±SD）Table II MDA Content in the Gastrocnemius of the Different Group Rats and the Test Result of the Activity of Antioxidant Enzyme(X±SD）

2.3.2 微壓氧對(duì)抗氧化酶活性的影響

機(jī)體抵抗自由基造成的細(xì)胞損傷主要靠自身的抗氧化防御系統(tǒng)，包括酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)。酶促系統(tǒng)主要包括：超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）等。

由表2可知，HM組與G組相比SOD活性顯著性增高（P＜0.05），而HQ組與對(duì)照組相比沒有顯著性差異。結(jié)果表明微壓氧可促進(jìn)SOD活性增加。

由表2可知，C組、大強(qiáng)度訓(xùn)練后HQ組和HM組大鼠CAT活性沒有顯著性差別。

由表2可知，大強(qiáng)度訓(xùn)練后HM組GSH-PX活性高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而HQ組雖有升高，但與C組相比不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HM組與HQ組相比，GSH-PX活性顯著性升高 （P＜0.05）。結(jié)果表明，微壓氧可顯著提高GSH-PX的活性。

2.4 腓腸肌組織形態(tài)學(xué)改變

根據(jù)圖1我們可以看到對(duì)照組大鼠骨骼肌結(jié)構(gòu)正常，在縱切片上可見排列緊密、規(guī)律的縱向肌纖維，肌纖維粗細(xì)均勻，肌間隙大小基本一致。明暗相間的肌橫紋清晰、整齊。大強(qiáng)度訓(xùn)練后HQ組骨骼肌肌間隙變大，橫紋消失，肌核分布不均，細(xì)胞核聚集；大強(qiáng)度訓(xùn)練后HM組與安靜恢復(fù)相比，癥狀得到改善，間質(zhì)水腫輕，肌核分布較均勻，損傷明顯低于HQ組。

圖1 腓腸肌纖維HE染色結(jié)果（×200）Figure 1 HE Staining Result of Gastrocnemius Fibre（×200）

3 分析討論

3.1 力竭時(shí)間的比較

運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間是機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的綜合表現(xiàn)，其不僅反映機(jī)體抗疲勞的能力，也反應(yīng)機(jī)體的抗應(yīng)激能力及對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：HM組與HQ組比較，大鼠跑至力竭時(shí)間明顯延長(zhǎng)，具有顯著性差異（P＜0.05）。說明大強(qiáng)度訓(xùn)練后微壓氧恢復(fù)能夠顯著提高大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間，增強(qiáng)大鼠的運(yùn)動(dòng)能力。我們的研究結(jié)果與彭兆云等[5]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)高壓氧預(yù)處理可以延長(zhǎng)小鼠的游泳力竭時(shí)間，郭洋琴[6]、滕進(jìn)忠等[7]的研究結(jié)果也證實(shí)高壓氧可以延長(zhǎng)大鼠游泳至力竭時(shí)間，提高大鼠運(yùn)動(dòng)耐力。我們推測(cè)可能是與通過加強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，促進(jìn)毛細(xì)血管增生、從而改善骨骼肌缺血缺氧有關(guān)。

3.2 微壓氧對(duì)大鼠腓腸肌中MDA含量及抗氧化酶活性的影響

長(zhǎng)時(shí)間、力竭運(yùn)動(dòng)會(huì)造成機(jī)體抗氧化能力下降，自由基生成與清除失去平衡，致使機(jī)體自由基產(chǎn)生過多，在體內(nèi)堆積。過多的自由基會(huì)加劇細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能受到損害，引起生物膜的功能障礙，使細(xì)胞內(nèi)外離子轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生紊亂，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性疲勞。大多數(shù)研究中以代謝過程中的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物為測(cè)定物和體內(nèi)的酶類抗氧化物質(zhì)等來(lái)評(píng)價(jià)體內(nèi)的抗氧化狀態(tài)。

許多研究顯示，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和力竭運(yùn)動(dòng)都會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成體內(nèi)自由基生成增多。Patlar等的研究中，健康男性采用Bruce方案進(jìn)行每周一次的力竭運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)前和后采集血樣，發(fā)現(xiàn)與靜止?fàn)顟B(tài)相比，力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致MDA上升，并具有顯著性差異[8]。趙越越的研究中，大強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)會(huì)造成運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)自由基增多，抗氧化能力下降，出現(xiàn)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷[9]。Jówko等的研究中，運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行重復(fù)的沖刺跑測(cè)試（4×15 s，間歇1 min），發(fā)現(xiàn)在沖刺跑后5 min以及24 h后，血清中MAD顯著性升高[10]。本研究與上述研究結(jié)果一致，大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌MDA含量顯著上升，而HM組MDA含量與C組沒有顯著性差異。HM組SOD活性顯著性高于C組，GSH-PX活性顯著高于C組和HQ組。研究結(jié)果表明微壓氧可以調(diào)節(jié)肌肉抗氧化酶的活性，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而起到減少骨骼肌損傷，提高運(yùn)動(dòng)能力的作用。Gregorevic等研究了高壓氧對(duì)于抗氧化酶活性的影響[11]。他們發(fā)現(xiàn)重復(fù)性吸入高壓氧可以上調(diào)趾長(zhǎng)伸肌肌肉和比目魚肌抗氧化酶的活性。Kim等研究了微壓氧對(duì)氧化應(yīng)激及疲勞的影響[2]。所有參與者在微壓氧前后進(jìn)行指標(biāo)測(cè)評(píng)。結(jié)果活性氧代謝物（ROM）在微壓氧前后有顯著性差異。結(jié)果揭示微壓氧可以有效的減少氧化應(yīng)激。然而，在本研究中，HM組CAT活性與C組和HQ組沒有顯著性差別，可能是CAT發(fā)揮作用具有一定的階段性和條件性。綜上所述，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成骨骼肌氧化應(yīng)激反應(yīng)，而微壓氧可上調(diào)抗氧化酶活性，從而維持自由基生成與清除之間的平衡。其機(jī)制可能是微壓氧可減少酸性代謝產(chǎn)物的堆積；提高組織血氧含量，促進(jìn)線粒體氧化功能；提高機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，加強(qiáng)清除自由基的能力。

3.3 微壓氧對(duì)大鼠骨骼肌組織形態(tài)學(xué)的影響

蘇木精-伊紅染色簡(jiǎn)稱HE染色，是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的細(xì)胞與組織學(xué)最廣泛應(yīng)用的染色方法。染色結(jié)果為細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿、肌肉、結(jié)締組織等呈不同程度的紅色。通過HE染色可以觀察骨骼肌組織的結(jié)構(gòu)，如肌外膜、肌核、肌纖維的形態(tài)及間質(zhì)小管、炎癥細(xì)胞等。本研究中，C組大鼠骨骼肌結(jié)構(gòu)正常，肌纖維排列緊密、規(guī)則、粗細(xì)均勻，肌間隙大小基本一致。肌核呈扁橢圓形，均勻分布在纖維周圍的肌膜下。大強(qiáng)度訓(xùn)練后HQ組肌纖維腫脹，肌核分布不均，出現(xiàn)核聚集，肌間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、小血管擴(kuò)張。大強(qiáng)度訓(xùn)練后HM組與HQ組相比，癥狀得到改善，損傷明顯低于HQ組。郭洋琴等的研究中，觀察了高壓氧對(duì)于游泳力竭大鼠肝臟、骨骼肌和腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)高壓氧恢復(fù)組肝臟、骨骼肌和腎臟損傷程度均輕于疲勞組[6]。滕進(jìn)忠等的研究也發(fā)現(xiàn)高壓氧對(duì)于疲勞大鼠腎臟具有保護(hù)作用，明顯改善腎臟組織的病理變化，起到保護(hù)疲勞大鼠腎臟組織的作用[7]。微壓氧對(duì)骨骼肌組織的保護(hù)作用可能是通過提高機(jī)體抗氧化酶活性，加強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，減輕自由基對(duì)于細(xì)胞膜的損害，從而保持細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)，維持身體的機(jī)能。

4 結(jié)論

4.1 大強(qiáng)度訓(xùn)練可造成骨骼肌氧化應(yīng)激損傷，造成運(yùn)動(dòng)能力下降。

4.2 微壓氧可提高骨骼肌抗氧化酶活性，減少骨骼肌脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高運(yùn)動(dòng)能力。

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