植物黃酮醇的檢測(cè)方法研究進(jìn)展

方 芳,王鳳忠

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

黃酮醇作為一類(lèi)重要的類(lèi)黃酮化合物,在自然界中廣泛分布[1]。因其具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗菌[4]、抗癌[5]等多種生理功能,對(duì)肥胖[6]、心腦血管疾病[7]及老年癡呆[8]等多種老年及慢性疾病具有重要的治療和預(yù)防作用,而成為人類(lèi)飲食中重要的功能活性因子。同時(shí)，因其對(duì)果蔬及食品的顏色[9]、口感及風(fēng)味[10]的形成具有重要作用,而成為食品科學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。因此，對(duì)植物原料及食品中的黃酮醇進(jìn)行定性定量分析對(duì)其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制、安全性評(píng)價(jià)、藥效研究及新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等均具有重要意義[11]。

黃酮醇雖具有重要的生理功能,但其多以結(jié)合態(tài)形式存在于植物及果蔬中,且極易在5-、3′-及4′-位點(diǎn)通過(guò)與葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、果膠糖、木糖及葡萄糖醛酸等糖分子結(jié)合形成穩(wěn)定的糖苷類(lèi)化合物[12]。由于黃酮醇糖苷類(lèi)化合物種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、異構(gòu)體多樣、商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)品缺乏,且分離檢測(cè)方法存在局限等問(wèn)題導(dǎo)致其分離提取及檢測(cè)分析十分困難[12-14]。因此了解植物黃酮醇分析檢測(cè)方法的研究進(jìn)展,對(duì)于現(xiàn)有黃酮醇類(lèi)化合物檢測(cè)方法的完善及新型檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)具有重要意義。本文對(duì)現(xiàn)有植物黃酮醇的檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述,以期為黃酮醇在食品、保健品及醫(yī)藥領(lǐng)域的深入研究及應(yīng)用提供理論依據(jù)及技術(shù)參考。

1 不同方法在植物黃酮醇提取中的應(yīng)用

1.1 紫外分光光度計(jì)法(UV spectrophotometer)

紫外分光光度計(jì)法是通過(guò)測(cè)定物質(zhì)在特定波長(zhǎng)下的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度來(lái)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析的方法[15]。是根據(jù)吸收光譜對(duì)目標(biāo)化合物的成分、結(jié)構(gòu)及與其它物質(zhì)間的相互作用進(jìn)行研究的有效手段[16]。與其它檢測(cè)方法相比較,紫外分光光度計(jì)法具有操作簡(jiǎn)單、儀器及檢測(cè)成本低、檢測(cè)時(shí)間短等特點(diǎn)[15,17],目前在醫(yī)藥領(lǐng)域黃酮類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)中應(yīng)用較多。趙猛等通過(guò)與化學(xué)計(jì)量學(xué)手段結(jié)合,成功構(gòu)建了一種可同時(shí)對(duì)紫花地丁中槲皮素和七葉內(nèi)酯含量進(jìn)行測(cè)定的紫外分光光度檢測(cè)法,該方法檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好,可作為中草藥中槲皮素含量測(cè)定的備選方法[18]。Chaudhari等采用紫外分光光度計(jì)建立了一種可同時(shí)對(duì)囊泡制劑中的蘆丁和槲皮素進(jìn)行檢測(cè)的方法,該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好,在257 nm和372 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下可分別對(duì)蘆丁和槲皮素進(jìn)行定量研究[19]。次年,Chaudhari等又利用紫外分光光度計(jì)建立了一種可同時(shí)對(duì)囊泡制劑中的槲皮素和鹽酸曲馬多進(jìn)行檢測(cè)的方法,該方法除可簡(jiǎn)單快速對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定外,還具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),在372 nm處可對(duì)槲皮素有效檢測(cè)[20]。陳志剛等建立了一種可對(duì)原料藥中槲皮素含量進(jìn)行快速測(cè)定的紫外分光光度檢測(cè)方法,該方法可在374 nm處對(duì)槲皮素含量進(jìn)行有效測(cè)定,精密度高,線(xiàn)性良好,回收率可達(dá)100.88%,滿(mǎn)足方法學(xué)要求,是測(cè)定原料藥中槲皮素含量的可行方法[17]。由此可見(jiàn),紫外分光光度計(jì)法作為植物類(lèi)黃酮化合物檢測(cè)的傳統(tǒng)方法,具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),但由于檢測(cè)過(guò)程中目標(biāo)化合物易受基質(zhì)溶液、檢測(cè)體系中其它組分及吸收池的潔凈程度等因素的干擾[18],導(dǎo)致其在植物黃酮醇類(lèi)化合物的檢測(cè)應(yīng)用中受到限制,目前有關(guān)天然黃酮醇類(lèi)化合物的檢測(cè)多應(yīng)用于傳統(tǒng)中草藥或藥物制劑的檢測(cè)中,且可檢目標(biāo)化合物的種類(lèi)有限,而針對(duì)食品等復(fù)雜基質(zhì)中的黃酮醇類(lèi)化合物的檢測(cè)研究較少。在后續(xù)研究中,如何有效克服復(fù)雜基質(zhì)及其它組分的干擾將成為未來(lái)紫外分光光度計(jì)法需要重點(diǎn)解決的問(wèn)題。

1.2 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)

高效液相色譜法是利用處于高壓環(huán)境中的待測(cè)化合物在固定相和流動(dòng)相間具有連續(xù)交換的特性,借助待測(cè)化合物在兩相間的分配系數(shù)、親和力及吸附能力的差異對(duì)其進(jìn)行分離的方法。其是在傳統(tǒng)液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型檢測(cè)方法[21],同時(shí)也是對(duì)植物類(lèi)黃酮化合物進(jìn)行檢測(cè)的最精選的方法。與紫外分光光度計(jì)法相比,其具有檢測(cè)限低、靈敏度高、分析效率高、分析范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[21-22]。高效液相色譜作為一種高效的分離體系,要實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)化合物的定性定量分析,最終需要與多種檢測(cè)體系相結(jié)合,目前應(yīng)用較多的包括紫外檢測(cè)、熒光檢測(cè)或二極管陣列檢測(cè)等檢測(cè)系統(tǒng)[12,23],而HPLC-UV和HPLC-DAD檢測(cè)法等也已成為從植物及食品原料中對(duì)黃酮醇等類(lèi)黃酮化合物進(jìn)行定性定量分析最為有效的方法之一[24-25]。Niu等通過(guò)反相高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)(RP-HPLC-DAD)建立了一種可對(duì)傳統(tǒng)中草藥返魂草(SeneciocannabifoliusLess)中9種黃酮醇類(lèi)化合物同時(shí)進(jìn)行分析檢測(cè)的方法。該方法采用C18柱為分離柱,乙腈水溶液為流動(dòng)相,經(jīng)梯度洗脫可對(duì)樣品中的黃酮醇類(lèi)化合物進(jìn)行有效分離及識(shí)別,9種黃酮醇的回收率均介于90.6%～102.5%之間,最低檢測(cè)限介于0.028～0.085 μg/mL之間。該方法靈敏度高、檢測(cè)效果良好,為中草藥黃酮醇類(lèi)化合物的檢測(cè)提供了一種行之有效的方法[25]。買(mǎi)買(mǎi)提·吐?tīng)栠d等通過(guò)高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)(HPLC-PAD)構(gòu)建了一種可對(duì)新疆不同品種巴旦杏中的槲皮素及山奈酚等黃酮醇類(lèi)化合物進(jìn)行定量研究的方法,該方法以甲醇-磷酸溶液(55∶45,V/V)為流動(dòng)相,在360 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下可對(duì)樣品中的槲皮素及山奈酚進(jìn)行良好分離,回收率高、線(xiàn)性范圍良好,可作為對(duì)巴旦杏進(jìn)行質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的理想檢測(cè)方法[26]。Benmeziane等采用HPLC-DAD法對(duì)3個(gè)不同鮮食紅葡萄品種的果皮黃酮醇進(jìn)行測(cè)定,共檢測(cè)到4種黃酮醇糖苷類(lèi)化合物,其中多以槲皮素糖苷類(lèi)化合物為主[27]。Ma等構(gòu)建了一種可對(duì)銀杏葉中黃酮醇類(lèi)化合物進(jìn)行快速檢測(cè)的HPLC檢測(cè)方法。該方法可在13 min內(nèi)對(duì)銀杏葉提取物中的黃酮醇苷元(槲皮素、山奈酚和異鼠李素)及糖苷類(lèi)化合物(蘆丁)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。通過(guò)對(duì)13種銀杏葉樣品,15種標(biāo)準(zhǔn)品提取物和10種銀杏葉產(chǎn)品進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)黃酮醇類(lèi)化合物的種類(lèi)和含量可作為判斷銀杏葉提取物及其相關(guān)產(chǎn)品是否摻假的重要依據(jù),從而為銀杏葉產(chǎn)品的鑒偽提供了切實(shí)可行的方法[28]。由此可見(jiàn),高效液相色譜法作為在傳統(tǒng)液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型檢測(cè)方法,目前在多種植物源食品及中草藥黃酮醇類(lèi)化合物的分析檢測(cè)中已得到應(yīng)用,其所檢出的化合物包括黃酮醇苷元及黃酮醇糖苷等多種。與紫外分光光度計(jì)法相比,具有檢測(cè)范圍廣、檢測(cè)限低、靈敏度高等優(yōu)勢(shì),但因其檢測(cè)設(shè)備成本較高、單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、操作步驟復(fù)雜、對(duì)樣品前處理要求高、試劑消耗量大等缺點(diǎn)[22,29]導(dǎo)致其在植物黃酮醇類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)中仍受到一定限制,而在復(fù)雜體系中無(wú)法對(duì)低含量化合物進(jìn)行有效分離和定量等問(wèn)題,也成為制約其在植物黃酮醇檢測(cè)中更加廣泛應(yīng)用的重要原因。因此在現(xiàn)有分離檢測(cè)體系上開(kāi)發(fā)更加高效和靈敏的分離和檢測(cè)技術(shù)及設(shè)備成為高效液相色譜法發(fā)展的必然趨勢(shì)。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)

液相色譜-紫外檢測(cè)法或液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法等因其具有成本相對(duì)較低、操作相對(duì)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)而在植物及食品類(lèi)黃酮化合物的檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[13,30]。但由于自然界中黃酮醇糖苷類(lèi)化合物種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,單純采用高效液相色譜結(jié)合普通檢測(cè)器很難實(shí)現(xiàn)對(duì)于某些含量較低的黃酮醇糖苷類(lèi)化合物的有效分離和準(zhǔn)確定量[13]。液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法因其在獲得紫外光譜信息的同時(shí),還可對(duì)目標(biāo)化合物的相對(duì)分子質(zhì)量和碎片離子進(jìn)行檢測(cè),對(duì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合解析,同時(shí)具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn),目前已成為對(duì)自然界中黃酮醇類(lèi)化合物進(jìn)行定性定量檢測(cè)最為常用的方法之一[31-32]。Yaque等通過(guò)LC-UV-ESI-MS/MS對(duì)銀杏(GinkgobilobaL.)花中的黃酮醇類(lèi)化合物進(jìn)行識(shí)別,發(fā)現(xiàn)槲皮素糖苷類(lèi)化合物是銀杏花的重要組分[33]。Wu等建立了可同時(shí)對(duì)綠茶、紅茶、烏龍茶中的黃酮醇等24種多酚類(lèi)化合物進(jìn)行檢測(cè)的HPLC-UV/ESI-MS檢測(cè)方法,該方法通過(guò)色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜信息同時(shí)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行識(shí)別,并對(duì)不同品種中的酚類(lèi)構(gòu)成進(jìn)行區(qū)分,發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品缺失的情況下,質(zhì)譜信息可作為識(shí)別目標(biāo)化合物的有力補(bǔ)充,該方法可作為檢測(cè)綠茶、紅茶及烏龍茶中黃酮醇等酚類(lèi)化合物的行之有效的方法[34]。Wu等通過(guò)高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometer,HPLC-TOF-MS)對(duì)4個(gè)不同野茶樹(shù)(Camelliasinensis)品種中的15種黃酮醇糖苷類(lèi)化合物進(jìn)行識(shí)別,并通過(guò)超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer,HPLC-QQQ-MS/MS)的多反應(yīng)檢測(cè)模式(multiple reaction monitoring,MRM)對(duì)黃酮醇糖苷類(lèi)化合物進(jìn)行定量,檢測(cè)限和定量限的結(jié)果顯示該方法比HPLC檢測(cè)法靈敏性高、數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好。黃酮醇在茶樹(shù)中多以單糖苷、雙糖苷及三糖苷等形式存在,且主要分布在嫩葉中,受試各茶樹(shù)品種中myricetin-3-O-galactoside的含量最高[13]。Souza等采用異亞丙基對(duì)黃酮醇葡糖苷和半乳糖苷異構(gòu)體進(jìn)行修飾,通過(guò)液相色譜串聯(lián)多級(jí)質(zhì)譜(LC-MSn)手段對(duì)黃酮醇葡糖苷異構(gòu)體和半乳糖苷異構(gòu)體進(jìn)行識(shí)別,發(fā)現(xiàn)該方法可有效解決黃酮醇糖苷異構(gòu)體難以識(shí)別的問(wèn)題,同時(shí)該方法為復(fù)雜基質(zhì)中多糖的識(shí)別提供了可能[14]。由此可見(jiàn),高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法因其可對(duì)物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量和碎片離子進(jìn)行有效獲取,對(duì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合解析等特點(diǎn)而成為繼傳統(tǒng)高效液相色譜檢測(cè)法后發(fā)展起來(lái)的新興的檢測(cè)方法。在檢測(cè)某些復(fù)雜化合物及低含量化合物時(shí)可作為傳統(tǒng)高效液相色譜檢測(cè)法的有力補(bǔ)充。目前在植物黃酮醇及其糖苷類(lèi)化合物的檢測(cè)中得到一定應(yīng)用,在黃酮醇糖苷類(lèi)化合物的識(shí)別上尤其發(fā)揮重要作用,通過(guò)對(duì)黃酮醇糖苷異構(gòu)體進(jìn)行適當(dāng)修飾,甚至可用于黃酮醇糖苷異構(gòu)體的識(shí)別領(lǐng)域。但該方法的缺點(diǎn)是檢測(cè)成本高,儀器普及性低,無(wú)法從復(fù)雜混合物中對(duì)目標(biāo)化合物的異構(gòu)體進(jìn)行有效識(shí)別,因此目前其應(yīng)用還十分有限[14,32]。而核磁共振雖可對(duì)化合物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效識(shí)別,但對(duì)樣品的純度和含量要求較高,而樣品純化過(guò)程通常費(fèi)時(shí)費(fèi)力,因此自然界中黃酮醇類(lèi)化合物的有效識(shí)別仍存在較大技術(shù)難題[14],高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法仍有很大改進(jìn)和發(fā)展空間。

1.4 超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)

超高效液相色譜法是在HPLC法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種全新的檢測(cè)方法。與HPLC法相比,其具有快速、高效、分辨率高、靈敏度好等特點(diǎn)[12]。近年來(lái)其在檢測(cè)難度較高的黃酮醇苷元及糖苷類(lèi)化合物的測(cè)定中也越發(fā)受到關(guān)注。Shim等構(gòu)建了一種可同時(shí)對(duì)食品中楊梅酮、槲皮素、山奈酚及異鼠李素等黃酮醇苷元進(jìn)行快速檢測(cè)的超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)法(UPLC-PDA)。該方法采用反相C18柱為分離柱,對(duì)楊梅酮、槲皮素、山奈酚及異鼠李素等黃酮醇類(lèi)化合物進(jìn)行分離,各物質(zhì)最低檢測(cè)限分別可達(dá)0.15、0.09、0.16和0.08 mg/kg,最低定量限分別為0.47、0.28、0.49和0.25 mg/kg。在保證各峰有效分離的情況下檢測(cè)時(shí)間僅需13 min,大大提高了食品中黃酮醇苷元類(lèi)化合物的檢測(cè)速度、靈敏度及分辨率[12]。張維冰等建立了一種通過(guò)超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(UPLC-PAD-MS/MS)對(duì)紅洋蔥中黃酮醇類(lèi)化合物進(jìn)行測(cè)定的方法,該方法不僅可對(duì)紅洋蔥中13種黃酮醇及其糖苷類(lèi)化合物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),而且可對(duì)紅洋蔥不同部位的黃酮醇類(lèi)化合物的分布和含量進(jìn)行區(qū)分,為洋蔥中黃酮醇類(lèi)化合物的測(cè)定提供了一種簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確性好的檢測(cè)方法[35]。Kim和Shim建立了一種可對(duì)蕎麥、紅茶、野生歐芹中12種黃酮醇糖苷類(lèi)化合物同時(shí)進(jìn)行測(cè)定的檢測(cè)方法。該方法采用UPLC對(duì)黃酮醇糖苷進(jìn)行分離,PDA對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),在350 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下,12種黃酮醇糖苷的回收率均較高,介于85.44%～108.79%之間,最低檢測(cè)限和最低定量限分別為0.32 mg/kg及0.97 mg/kg。方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高,為植物黃酮醇糖苷類(lèi)化合物的檢測(cè)提供了新的選擇[32]。王智聰?shù)韧ㄟ^(guò)超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-PD-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)茶葉中黃酮醇糖苷類(lèi)化合物進(jìn)行測(cè)定,在綠茶和紅茶中共識(shí)別到15種黃酮醇糖苷類(lèi)化合物,其中包括6種槲皮素糖苷、3種楊梅酮糖苷及6種山奈酚糖苷類(lèi)化合物。經(jīng)串聯(lián)四極桿質(zhì)譜對(duì)樣品中黃酮醇糖苷類(lèi)化合物進(jìn)行定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),黃酮醇糖苷類(lèi)化合物在綠茶和紅茶中的含量和分布存在顯著差異(p<0.05),其中綠茶中的黃酮醇糖苷類(lèi)化合物總量約為紅茶的1.7倍。經(jīng)驗(yàn)證該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確,可作為茶葉中黃酮醇糖苷類(lèi)化合物分析檢測(cè)的可行方法[31]。Jiang等首次采用UPLC法對(duì)綠茶、烏龍茶及紅茶中的黃酮醇糖苷類(lèi)化合物進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜共識(shí)別到18種黃酮醇糖苷類(lèi)化合物,所檢測(cè)到的黃酮醇糖苷類(lèi)化合物的總量為2.32～5.67 g/kg。在對(duì)不同茶種中的黃酮醇糖苷類(lèi)化合物進(jìn)行對(duì)比分析時(shí)發(fā)現(xiàn),黃酮醇糖苷在綠茶、烏龍茶及紅茶中的總量無(wú)顯著差別,但不同茶種中的單體黃酮醇糖苷種類(lèi)和含量不同,其中綠茶中以山奈酚糖苷為主,烏龍茶中以槲皮素和楊梅酮糖苷為主,而紅茶中則以槲皮素糖苷類(lèi)化合物為主,證明該方法可作為區(qū)分不同茶種的重要依據(jù)[36]。由此可見(jiàn),超高效液相色譜法因其采用更高的壓力和更短的色譜柱,使得其色譜峰的分散度變小,檢測(cè)速度、分辨率及敏感性顯著提高,較之傳統(tǒng)HPLC檢測(cè)法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)效率和靈敏度高、對(duì)目標(biāo)化合物的分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[12,31]。目前其在包括茶葉、洋蔥、銀杏等多種食品和植物的黃酮醇苷元及糖苷類(lèi)化合物的檢測(cè)和定性定量研究中已得到一定應(yīng)用,在食品摻假和植物品種或組織部位的識(shí)別和區(qū)分上可作為重要參考。

1.5 毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis,CE)

毛細(xì)管電泳法是以毛細(xì)管為分離平臺(tái),高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力,根據(jù)目標(biāo)化合物在特定環(huán)境中的淌度及分配行為不同對(duì)其進(jìn)行分離的一種液相分離技術(shù)。其是現(xiàn)代微柱分離技術(shù)與傳統(tǒng)電泳技術(shù)完美結(jié)合的產(chǎn)物[37]。與傳統(tǒng)色譜檢測(cè)方法相比,毛細(xì)管電泳法具有柱效高、分辨率好、自動(dòng)化程度高、適用范圍廣、分析時(shí)間短、前處理簡(jiǎn)單、對(duì)試劑及樣品的消耗量小、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[23,29,38]。作為HPLC法的重要替代方法目前已在植物及食品黃酮醇類(lèi)化合物的分析中得到廣泛關(guān)注[23,29]。郭芳芳等通過(guò)高效毛細(xì)管電泳法對(duì)不同產(chǎn)區(qū)苦蕎中的黃酮醇類(lèi)化合物進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在優(yōu)化的電泳條件下,蘆丁、槲皮素、山奈酚等黃酮醇類(lèi)化合物可以得到良好分離,在7 min的檢測(cè)時(shí)間內(nèi),各物質(zhì)的最低檢測(cè)限分別可達(dá)1.80×10-5、1.24×10-5和2.51×10-5mg/mL,平均回收率介于95.5%～104.7%之間,證明該方法可作為檢測(cè)苦蕎中黃酮醇類(lèi)化合物準(zhǔn)確可靠的方法[39]。Gatea等建立了一種可在27 min內(nèi)對(duì)蜂膠及植物提取物中20種多酚類(lèi)化合物進(jìn)行測(cè)定的毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法,該方法可對(duì)蘆丁、槲皮素、山奈酚及高良姜素等黃酮醇類(lèi)化合物進(jìn)行良好分離,在優(yōu)化的電泳條件下各化合物最低檢測(cè)限和定量限分別介于0.02～1.75 μg/mL和0.07～5.77 μg/mL之間[23]。Wang等采用毛細(xì)管電泳結(jié)合安培檢測(cè)法建立了一種可對(duì)傳統(tǒng)中草藥中8種類(lèi)黃酮化合物進(jìn)行分離檢測(cè)的方法,在分離電壓2000 V,緩沖液濃度18 mmol/L,溶液pH為10.2的條件下,可對(duì)蘆丁、槲皮素、槲皮甙、山奈酚及芹菜素等黃酮醇類(lèi)化合物在33 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好分離,且檢測(cè)限均較低。采用該方法可對(duì)包括沙棘、貫葉連翹和側(cè)柏葉等傳統(tǒng)中草藥中的蘆丁、槲皮素、槲皮甙和山奈酚等化合物成功檢出,且各化合物的回收率均較高,分別介于84.7%～113%之間,證明該方法可用于傳統(tǒng)中草藥中黃酮醇類(lèi)化合物的定性定量研究[40]。Memon等采用毛細(xì)管電泳結(jié)合光電二極管陣列檢測(cè)器(CE-PAD)建立了一種可對(duì)水果中類(lèi)黃酮化合物進(jìn)行快速分離的檢測(cè)方法。在緩沖液濃度為10 mmol/L,pH為8.5,檢測(cè)電壓為25 kV時(shí),可對(duì)蘆丁及槲皮素等黃酮醇類(lèi)化合物進(jìn)行有效分離,方法穩(wěn)定性高,重現(xiàn)性好,可作為水果及果汁中黃酮醇類(lèi)化合物檢測(cè)的有效方法[38]。由此可見(jiàn),毛細(xì)管電泳法目前已在多種植物及食品的黃酮醇類(lèi)化合物檢測(cè)中得到探索性應(yīng)用,所檢測(cè)的黃酮醇類(lèi)化合物的種類(lèi)日益增多。作為HPLC法的重要替代方法其在植物及食品中包括黃酮醇類(lèi)化合物在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)的檢測(cè)中具有很好的應(yīng)用前景[23,29]。但毛細(xì)管電泳法因其分離機(jī)理不同,具有包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis,CZE)、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(micellar electrophoresis capillary chromatography,MECC)、毛細(xì)管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis,CGE)、毛細(xì)管等電聚焦(capillary isoelectric focusing,CIEF)、毛細(xì)管等速電泳(capillary isoelectric-phoresis,CITP)等多種分離模式和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)(LIF)、紫外檢測(cè)(UV)、質(zhì)譜檢測(cè)(MS)及安培檢測(cè)(AD)等多種檢測(cè)方法[37,40],目前在植物黃酮醇類(lèi)化合物檢測(cè)上的應(yīng)用模式還十分有限,在后續(xù)研究中還有待進(jìn)一步拓寬。

1.6 電化學(xué)檢測(cè)法(electrochemical detection,ED)

雖然目前植物黃酮醇類(lèi)化合物的檢測(cè)多以紫外分光光度計(jì)法、色譜法等進(jìn)行,但分光光度計(jì)法的選擇性差,色譜法分析時(shí)間長(zhǎng)、試劑消耗量大、檢測(cè)成本高[29],且對(duì)前處理的要求高,程序復(fù)雜、設(shè)備昂貴,從而給黃酮醇類(lèi)化合物的檢測(cè)分析帶來(lái)諸多不便,因此近年來(lái)一些新興的電化學(xué)實(shí)驗(yàn)手段也在逐漸涌現(xiàn)[41-42]。電化學(xué)檢測(cè)法是以研究對(duì)象的電響應(yīng)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的分析方法,其通過(guò)對(duì)電池參數(shù)變化的測(cè)定可獲得目標(biāo)物質(zhì)的含量及電化學(xué)性質(zhì)[11]。由于黃酮醇類(lèi)化合物具有明顯的電化學(xué)活性,因此電化學(xué)檢測(cè)法是較適合植物黃酮醇檢測(cè)的方法[43]。Wang等采用多壁碳結(jié)合1-十二烷基-3-甲基咪唑復(fù)合電極對(duì)蘆丁進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)該電極對(duì)蘆丁的氧化還原反應(yīng)具有電催化作用,通過(guò)電荷轉(zhuǎn)移系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)速率常數(shù)可得蘆丁電化學(xué)參數(shù),其最低檢測(cè)限可達(dá)0.01 μmol/L,由于該電極較之其它離子性液體電極具有更好的電化學(xué)性能,靈敏度高、穩(wěn)定性好,可有效排除雜質(zhì)干擾,為蘆丁的檢測(cè)提供了切實(shí)可行的方法[44]。Sun等采用基于結(jié)合石墨烯聚吡咯膜的分子印記聚合物對(duì)槲皮素進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定,采用差動(dòng)脈沖伏安法對(duì)槲皮素的電化學(xué)行為進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該方法具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性,可有效排除雜質(zhì)化合物的干擾,槲皮素的檢測(cè)限可達(dá)4.8×10-8mol/L,證明該方法可用于復(fù)雜基質(zhì)中槲皮素的檢測(cè)[43]。Arvand和Anvari采用石墨烯修飾的玻碳電極為反應(yīng)電極,通過(guò)差動(dòng)脈沖伏安法對(duì)蘋(píng)果和洋蔥中的槲皮素的電化學(xué)行為進(jìn)行分析并對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定,確定槲皮素的檢測(cè)限為3.6 nmol/L,證明該方法可用于食品中槲皮素的檢測(cè)[42]。王微采用分子印跡技術(shù),分別以槲皮素、桑色素等黃酮醇類(lèi)化合物為印記分子,利用電化學(xué)聚合的方法開(kāi)發(fā)了一種黃酮醇分子印跡鄰苯二胺薄膜電化學(xué)傳感器,并對(duì)槲皮素及桑色素等黃酮醇類(lèi)化合物的最佳測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)該方法靈敏度高、選擇性好,對(duì)銀杏葉類(lèi)藥物中槲皮素含量測(cè)定的回收率可達(dá)99.2%～102%之間,可作為植物黃酮醇測(cè)定的可行方法[45]。由此可見(jiàn),電化學(xué)檢測(cè)法作為一種快速、高效、靈敏度高、檢測(cè)限低的檢測(cè)方法[11],目前其在植物黃酮醇的檢測(cè)中已得到一定應(yīng)用。有關(guān)電極種類(lèi)、材料、測(cè)定方法及目標(biāo)化合物的種類(lèi)等方面的研究正日益深入。電化學(xué)測(cè)定法作為一種以電化學(xué)反應(yīng)原理及目標(biāo)物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法,其較適用于具有電化學(xué)特性的黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)[11],在未來(lái)研究中還有很大的發(fā)展空間。

2 問(wèn)題與展望

黃酮醇作為與人體健康密切相關(guān)的生物活性因子,其種類(lèi)及含量的多少是衡量其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要依據(jù),因此開(kāi)發(fā)合適的定性定量分析檢測(cè)方法對(duì)其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制、安全性評(píng)價(jià)、藥效分析及新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等均具有重要意義。但黃酮醇類(lèi)化合物種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、異構(gòu)體多樣、商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)品缺乏等問(wèn)題給其分析檢測(cè)工作帶來(lái)極大障礙及困難,因此如何從植物原料中對(duì)黃酮醇類(lèi)化合物進(jìn)行有效檢測(cè)便顯得尤為重要。近年來(lái)紫外分光光度計(jì)法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法、超高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法及電化學(xué)檢測(cè)法等多種分析檢測(cè)方法已在植物黃酮醇的測(cè)定過(guò)程中得到應(yīng)用,但相關(guān)研究工作范圍較窄、所涉及的植物或食品種類(lèi)及目標(biāo)化合物種類(lèi)均存在較大局限,且現(xiàn)有檢測(cè)方法的構(gòu)建缺乏系統(tǒng)性和延續(xù)性。

針對(duì)上述問(wèn)題,未來(lái)在植物黃酮醇檢測(cè)方法的研究中,應(yīng)注意將目標(biāo)化合物自身的性質(zhì)和現(xiàn)有檢測(cè)方法的特點(diǎn)有機(jī)結(jié)合,充分發(fā)揮不同檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì),彌補(bǔ)其不足,加強(qiáng)分析檢測(cè)工作的系統(tǒng)性和連貫性。在應(yīng)用紫外分光光度計(jì)法時(shí)應(yīng)注意開(kāi)發(fā)可有效縮減或排除基質(zhì)及檢測(cè)體系中其它組份干擾的方法。在應(yīng)用色譜檢測(cè)法時(shí)應(yīng)注意開(kāi)發(fā)可有效縮短檢測(cè)時(shí)間、減少試劑用量、降低檢測(cè)成本的方法。在應(yīng)用毛細(xì)管電泳檢測(cè)法時(shí)注意加強(qiáng)對(duì)新型檢測(cè)模式的探索。在電化學(xué)檢測(cè)法的應(yīng)用過(guò)程中注意加強(qiáng)新型檢測(cè)電極及材料的開(kāi)發(fā)等。

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