基于熒光差異雙向電泳的雷帕霉素?fù)p傷人冠狀動脈內(nèi)皮細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究*

劉少軍，胡坤華，鐘 赟△

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科/廣州心血管疾病研究所，廣州 510260；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣州 510089)

介入治療正日益成為冠心病的首選治療方式[1]，安裝藥物洗脫支架是目前介入治療的常規(guī)手段。臨床上發(fā)現(xiàn)雷帕霉素在冠心病的治療應(yīng)用中具有雙重性：一方面抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，有效防止了介入術(shù)后的再狹窄；另一方面雷帕霉素抑制內(nèi)皮細胞增殖和遷移，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷[2-3]。雷帕霉素延緩支架被正常內(nèi)皮細胞覆蓋包裹，增加血栓風(fēng)險，影響遠期療效。雷帕霉素洗脫支架植入相關(guān)的支架內(nèi)血栓，成為介入術(shù)后患者重要的致死、致殘因素[2-4]。明確雷帕霉素誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞受損的具體分子機制是克服其不良反應(yīng)的關(guān)鍵。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)作為篩選手段，系統(tǒng)探索雷帕霉素?fù)p傷血管內(nèi)皮細胞作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 雷帕霉素、硫脲、賴氨酸、二甲基甲酰胺等購自美國Sigma公司;CHAPS、甘氨酸、尿素、低熔點瓊脂糖、蛋白質(zhì)純化試劑盒Clean-up Kit、定量試劑盒Quant Kit、玻璃板硅烷化劑、固相IPG干膠條、IPG buffer、三氟乙酸、熒光標(biāo)記試劑盒[CyDye DIGE Flour (minimal Dye) Labelling Kit]、Deep purple熒光染料購自美國GE Healthcare公司;正丁醇購自德國Merck公司,乙腈購自美國Fisher公司，測序級胰酶購自美國Promega公司。

1.1.2儀器 等電聚焦電泳儀IPGphor Ⅲ、垂直電泳儀Ettan DALT Six System SDS、掃描儀Typhoon Trio、切膠儀Ettan Picker、酶解儀Ettan Digester、分析軟件DeCyder V7.0 Software均購自美國GE Healthcare公司；MALDI-ToF-ToF質(zhì)譜儀購自美國Bruker Dalton公司。

1.2方法

1.2.1人冠狀動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)和處理 參考已經(jīng)報道的方法[5-6]。人冠狀動脈內(nèi)皮細胞HCAECs購自美國Cell Applications公司，培養(yǎng)按照說明書進行操作，本研究所使用的HCAECs為第4代。藥物處理細胞之前，改為含0.1 % 胎牛血清且不含細胞因子的EGM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。實驗組為HCAECs用1 μmol/L雷帕霉素處理4 h。

1.2.2樣品處理 在4 ℃預(yù)冷蔗糖緩沖液(10 mmol/L Tris，250 mmol/L sucrose)中洗滌細胞3次，去除殘余培養(yǎng)基；每個100 mm皿中加入裂解液(7 mol/L Urea，2 mol/L Thiourea，30 mmol/L Tris，4% CHAPS)250 μL，刮下細胞并充分裂解；超聲，4 ℃、12 000 g離心30 min，轉(zhuǎn)移上清液，進行蛋白質(zhì)純化。蛋白質(zhì)的純化和定量嚴(yán)格按照2D Clean-up Kit或2D Quant Kit說明書進行。

1.2.3熒光差異雙向電泳(2D-DIGE) 參照報道過的方法[7-8]，采用2D-DIGE研究的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計,樣品的熒光標(biāo)記方法按照CyDye DIGE Flour Labelling Kit說明書操作。每個樣品取50 μg，用400 pmol Cy2、Cy3或者Cy5 在冰浴、避光條件下標(biāo)記30 min；然后用賴氨酸溶液終止反應(yīng)。第一向電泳(等電聚焦)程序如下：30 V，12 h，step-n-hold；500 V，1 h，step-n-hold；1 000 V，1 h，step-n-hold；10 000 V，10 h，step-n-hold；Total 85 000 Vh。先后用DTT和IAA溶液進行兩步平衡，然后進行第二向12.5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)。

1.2.4凝膠掃描和差異蛋白的獲取 準(zhǔn)備制備膠2張(每膠500 μg)，用Deep Purple stain kit進行制備膠的熒光染色。Typhoon Trio掃描儀對2D-DIGE 分析膠和Deep Purple制備膠的圖像進行采集。DeCyder7.0軟件進行差異蛋白分析，在Ettan Picker上切取差異蛋白質(zhì)樣品。

1.2.5蛋白質(zhì)鑒定 切取的目的蛋白斑點在Ettan Digester儀器上進行胰酶酶解，然后在MALDI-ToF-ToF質(zhì)譜儀上進行蛋白質(zhì)的鑒定，Mascot進行數(shù)據(jù)檢索。

2 結(jié) 果

2.12D-DIGE蛋白質(zhì)組學(xué)研究 雷帕霉素處理后，HCAECs差異表達蛋白有85個，其中上調(diào)49個，下調(diào)36個，見圖1。

表1 2D-DIGE結(jié)合MALDI-ToF-ToF發(fā)現(xiàn)的差異蛋白表達

續(xù)表1 2D-DIGE結(jié)合MALDI-ToF-ToF發(fā)現(xiàn)的差異蛋白表達

圖1 雷帕霉素誘導(dǎo)HCAECs損傷的2D-DIGE研究

2.2差異表達蛋白及其功能分類 挑選2D-DIGE發(fā)現(xiàn)的差異蛋白斑點50個，進行MALDI-ToF-ToF質(zhì)譜鑒定，共鑒定出雷帕霉素誘導(dǎo)的HCAECs差異表達蛋白26種(不含重復(fù)的4個)，見表1。主要有以下幾類：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白、線粒體蛋白、分子伴侶、結(jié)構(gòu)蛋白和抗氧化蛋白等，符合細胞損傷的特征，見圖2、3。

圖2 雷帕霉素誘導(dǎo)的HCAECs差異表達蛋白的功能分類

圖3 雷帕霉素誘導(dǎo)蛋白HYOU1、ERP44和的表達變化

3 討 論

內(nèi)皮細胞功能紊亂不僅是動脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素之一，也是支架后血栓形成的重要原因。雷帕霉素是洗脫支架最常用的藥物之一，其藥理作用主要是誘導(dǎo)細胞周期停滯、抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，從而抑制內(nèi)膜增生[2-3]。雷帕霉素直接靶向并抑制絲/蘇氨酸激酶mTOR，激活自噬。因此，從分子機制上來說，雷帕霉素具有阻滯細胞周期、抑制細胞的增殖和遷移，以及誘導(dǎo)細胞損傷的作用。

為了系統(tǒng)研究雷帕霉素對人冠狀動脈內(nèi)皮細胞作用的分子機制，筆者采用了蛋白質(zhì)組學(xué)的策略，利用2D-DIGE結(jié)合MALDI-ToF-ToF的方法。本研究共發(fā)現(xiàn)差異蛋白斑點85個，質(zhì)譜鑒定出其中的26種蛋白質(zhì)。包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白、線粒體蛋白、分子伴侶、泛素系統(tǒng)相關(guān)蛋白等，符合細胞損傷的特征。本研究發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白包括HYOU1(即ORP-150)、PDIA3(即ERP57)、TXND5(即ERP46)、ERP44,這幾類蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān),提示雷帕霉素?fù)p傷內(nèi)皮細胞的機制之一可能是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。HYOU1在血管細胞中通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷發(fā)揮作用[9]。雷帕霉素誘導(dǎo)了HYOU1下調(diào)1.63倍，促使其保護效應(yīng)減弱。筆者發(fā)現(xiàn)雷帕霉素下調(diào)了ERP44表達2.11倍，報道稱干擾ERP44的表達會促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷[10]，而ERP57表達上調(diào)可能是一種應(yīng)激性反應(yīng)。已經(jīng)報道雷帕霉素的靶點mTOR與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間的關(guān)系較為復(fù)雜，存在多種形式的互相影響[11-12]。眾所周知，雷帕霉素是自噬研究最常用的誘導(dǎo)劑。雷帕霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的機制之一就是mTORC1與ATG1/ULK復(fù)合物分離，

促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的成核和延伸[11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬已經(jīng)成為當(dāng)前研究的一個熱點。雷帕霉素誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬是通過怎樣的機制，也是以后值得關(guān)注和深入研究的一個方向。

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