金關(guān)片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

羅亞玲李 冰，耿 昭茍 琰（.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院，成都673；.樂山市中醫(yī)醫(yī)院，四川 64000）

金關(guān)片是雅安三九藥業(yè)有限公司的獨(dú)家產(chǎn)品，是含有雷公藤的復(fù)方制劑，具有補(bǔ)益肝腎、祛寒止痛、活血通絡(luò)、增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)功能、免疫調(diào)整等作用，適用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、增生性關(guān)節(jié)炎等病癥[1]。金關(guān)片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中收載項(xiàng)目：性狀、雷公藤中雷公藤甲素液相色譜鑒別、續(xù)斷中皂苷的薄層鑒別、丹參的薄層鑒別、黃芪中黃芪甲苷的薄層鑒別、附子中烏頭堿薄層限量檢查、雷公藤中雷公藤甲素的含量測定。本研究為了更好地控制藥品質(zhì)量，增加對處方中淫羊藿、丹參的薄層鑒別研究，同時對原標(biāo)準(zhǔn)的薄層鑒別方法進(jìn)行優(yōu)化，并采用高效液相色譜（HPLC）法對附子中雙酯型烏頭堿進(jìn)行限量檢查，增加了專屬性，保證了該品種的用藥安全；根據(jù)樣品的含量測定結(jié)果，修訂了雷公藤甲素的含量測定限度。

1 材料與方法

1.1 儀器及試藥

1.1.1 儀器 CAMAG薄層成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司）；島津LC20 HPLC儀[四元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列（DAD）檢測器]，Waters2695 HPLC儀（四元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器）；Agilent1200HPLC儀（四元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器）；CPA225電子天平；SB-5200超聲波清洗器。

1.1.2 試藥 金關(guān)片（雅安三九藥業(yè)有限公司，批號：K-131201、K-131202、K-131203、K-131204、K-131205、K-131206、K-131207、K-131208、K-131209、K-131203、K-131210）、續(xù)斷（121033-200608）、龍膽苦苷（110770-201013）、丹參（120923-201113）、淫羊藿苷（110737-200415）、黃芪甲苷（110781-200613）、烏頭堿（110720-201111）、新烏頭堿（110799-201106）、次烏頭堿（110567-200603）、雷公藤甲素（110567-200603）由中國食品藥品檢定研究院提供。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，陰性樣品為自制。

1.2 方法

1.2.1 續(xù)斷的鑒別

1.2.1.1 供試液的制備 取本品20片，除去包衣，研細(xì)，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，用乙醚振搖提取2次，每次15 mL，棄去乙醚液，水液用正丁醇振搖提取2次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次10 mL，棄去氨試液，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。采用同樣的方法制成續(xù)斷陰性樣品溶液。

1.2.1.2 對照藥材溶液的制備 取續(xù)斷對照藥材0.5 g，加甲醇15 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為對照藥材溶液。

1.2.1.3 展開條件 續(xù)斷鑒別采用硅膠板G板，以正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5）的上層溶液為展開劑[2]，以 10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.2.2 淫羊藿的鑒別

1.2.2.1 供試液的制備 取本品20片，除去包衣，研細(xì)，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，用乙醚振搖提取2次，每次15 mL，棄去乙醚液，水液用正丁醇振搖提取2次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次10 mL，棄去氨試液，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。采用同樣的方法制成淫羊藿陰性樣品溶液。

1.2.2.2 對照品溶液的制備 取淫羊藿苷對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

1.2.2.3 展開條件[3]淫羊藿苷的鑒別采用硅膠G板，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1）為展開劑，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.2.3 丹參的鑒別[4]

1.2.3.1 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，研細(xì)，加75%甲醇50 mL，超聲處理5 min，濾過，濾液蒸至無醇味，加甲酸0.5 mL，用乙酸乙酯振揺提取2次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。采用同樣的方法制成陰性樣品溶液。

1.2.3.2 對照藥材溶液的制備 另取丹參對照藥材0.2 g，加75%甲醇25 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加1 mL甲醇使溶解，作為對照藥材溶液。

1.2.3.3 展開條件 采用硅膠G板，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2）為展開劑，以 5% 磷鉬酸乙醇溶液為顯色劑。

1.2.4 秦艽、黃芪的鑒別[5-7]

1.2.4.1 供試品溶液的制備 取本品50片，除去包衣，研細(xì)，加甲醇100 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液加于已處理好的中性氧化鋁柱（100～200目，20 g，內(nèi)徑15 mm）上，用40%甲醇150 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至約15 mL，水液用水飽和的正丁醇振揺提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次20 mL，棄去水液，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。采用同樣的方法制成秦艽和黃芪陰性樣品溶液。

1.2.4.2 對照品溶液的制備 分別取龍膽苦苷和黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

1.2.4.3 展開條件 秦艽的鑒別采用硅膠板GF254板，以乙酸乙酯-甲醇-水（10∶2∶1）為展開劑。黃芪的鑒別采用硅膠 G 板，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置分層的下層溶液為展開劑，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.2.5 雙酯型烏頭堿限量檢查

1.2.5.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 采用AQ Welch C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動相：流動相 A為乙腈-四氫呋喃（25∶15），流動相B為0.1 mol/L醋酸鈉溶液（每1 000毫升加冰乙酸0.5 mL），按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，檢測波長為235 nm。

表1 流動相梯度（%）

1.2.5.2 溶液的制備 取本品20片，研細(xì)，加氨水10 mL使?jié)櫇瘢右颐鸦亓魈崛?次，第1次1 h，第2次30 min，每次50 mL，殘渣用乙醚20 mL分次洗滌，合并提取液和洗滌液，40℃蒸干，殘渣加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）使溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，濾過，取續(xù)濾液，即得，作為供試品溶液。另取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品，加無水乙醇分別制成每毫升含5 μg的溶液，作為對照品溶液。再取本品20片，研細(xì)，精密加入對照品溶液5 mL，加氨水10 mL使?jié)駶?，同供試品處理方法制成加樣溶液?/p>

1.2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取混合對照品溶液，采用倍比稀釋法制成系列濃度的溶液，在“1.2.5.1”項(xiàng)色譜條件下，進(jìn)樣量10 μL，記錄色譜峰面積。

1.2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批金關(guān)片，按“1.2.5.2”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，在“1.2.5.1”項(xiàng)色譜條件下，取供試品溶液和對照品溶液各進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。

1.2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取雙酯型烏頭堿混合對照品溶液共6份，分別置于6個錐形瓶中，揮干溶劑，分別取樣品（K-131203，不含雙酯型烏頭堿）20片，除去薄膜衣，研細(xì)，置于以上錐形瓶中，按“1.2.5.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液。取供試品溶液和對照品溶液各10 μL 進(jìn)樣。

1.2.5.6 樣品的測定 按“1.2.5.1”“1.2.5.2”項(xiàng)方法制備并測定，分別對10批次的金關(guān)片樣品中雙酯型烏頭堿進(jìn)行含量測定。

1.2.6 雷公藤甲素的含量測定

1.2.6.1 色譜條件 色譜柱：AQ Welch C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈-0.3% 的磷酸二氫鉀溶液（22∶78）；流速：1.0 mL/min；檢測波長220 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35℃；理論板數(shù)按雷公藤甲素峰計算，應(yīng)不低于7 000。

1.2.6.2 對照品溶液的制備 取雷公藤甲素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含10 μg的溶液，即得。

1.2.6.3 供試品溶液的制備 取本品50片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，稱取細(xì)粉6 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇-二氯甲烷（1∶1）100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，放置過夜，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）20 min，再稱定質(zhì)量，用甲醇-二氯甲烷（1∶1）補(bǔ)足減失的重量，濾過，精密量取續(xù)濾液50 mL，蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，加于中性氧化鋁柱[100～200目，15 g，內(nèi)徑1.5 cm，用甲醇-二氯甲烷（1∶3）濕法裝柱]上，用甲醇-二氯甲烷（1∶3）10 mL分次洗滌殘渣，洗液加于柱上，繼續(xù)用甲醇-二氯甲烷（1∶3）洗脫，收集洗脫液 80 mL，蒸干，殘渣用甲醇使溶解并定量轉(zhuǎn)移入5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.6.4 樣品測定 按“1.2.6.1”“1.2.6.2”項(xiàng)下方法制備并測定，分別對10批次金關(guān)片中雷公藤甲素進(jìn)行含量測定。

2 結(jié) 果

2.1 續(xù)斷的薄層鑒別 供試品色譜中，在與續(xù)斷對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照未見干擾。見圖1。

圖1 續(xù)斷的薄層色譜（TLC）圖譜

2.2 淫羊藿的薄層鑒別 供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照未見干擾。見圖2。

圖2 淫羊藿在紫外光燈365 nm的TLC圖譜

2.3 丹參的薄層鑒別 供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照未見干擾。見圖3。

圖3 丹參的TLC圖譜

2.4 秦艽、黃芪的鑒別 供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照未見干擾。見圖4A、4B。

圖4 秦艽和黃芪在紫外光燈365 nm的TLC圖譜

圖5 金關(guān)片中雙酯型烏頭堿HPLC圖

2.5 雙酯型烏頭堿限量檢查結(jié)果

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果 以峰面積作為縱坐標(biāo)，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/mL）作為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，各組分的回歸方程分別為：Y新烏頭堿=614 109X+102 284[相關(guān)系數(shù)（r）=0.9995]、Y次烏頭堿=756 449X-8 043（r=0.999 9）、Y烏頭堿=775 803X+15 728（r=0.999 9）。2.287～22.872 μg/mL 新烏頭堿、2.938～29.381μg/mL次烏頭堿、3.446～34.461μg/mL烏頭堿3種雙酯型烏頭堿與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖5。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 6份樣品均未檢出雙酯型烏頭堿，重復(fù)性良好。

2.5.3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 新烏頭堿的平均回收率為94.4%，標(biāo)準(zhǔn)誤差（RSD）為 1.57（n=6）；次烏頭堿的平均回收率為95.7%，RSD為1.78（n=6）；烏頭堿的平均回收率為 99.15%，RSD為 1.10（n=6）。

2.5.4 樣品的測定結(jié)果 10批樣品烏頭堿每片含量分別為 0.31、0.29、0.00、0.52、0.53、0.40、0.49、0.43、0.44、0.00 μg。

2.6 雷公藤甲素的含量測定 10批樣品雷公藤甲素每片含量為 1.9、2.1、1.9、1.7、2.0、1.5、1.4、2.1、1.8、1.6 μg。

3 討 論

新增的秦艽、淫羊藿薄層鑒別研究中，根據(jù)2種藥材所含化學(xué)成分的性質(zhì)，分別采用原標(biāo)準(zhǔn)黃芪、續(xù)斷薄層鑒別用的供試品溶液，以滿足經(jīng)濟(jì)檢驗(yàn)、科學(xué)檢驗(yàn)及環(huán)保檢驗(yàn)的目的。

原標(biāo)準(zhǔn)采用TLC法對烏頭堿進(jìn)行了限量檢查，但對次烏頭堿、新烏頭堿未進(jìn)行控制，難以保證產(chǎn)品的安全性，通過研究，采用HPLC法對3種雙酯型烏頭堿均進(jìn)行限量檢查；在供試品制備上進(jìn)行了大量的考察，最終選用乙醚提取2次回收率最高，建立的方法檢測靈敏度更高，結(jié)果更可靠。

原標(biāo)準(zhǔn)采用HPLC法測定雷公藤甲素的含量，每片限度為1.0～10.0 μg，范圍較寬。雷公藤甲素既是雷公藤中有效成分，也是有毒成分。測定了10批樣品，每片含量結(jié)果為1.4～2.1μg，根據(jù)測定結(jié)果，將其限度修訂為每片1.0～5.0 μg，縮小了含量限度范圍，以保證產(chǎn)品的安全有效。

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