香榧種子抑制其發(fā)芽和生長的內(nèi)源物篩選研究

劉 序 陳 黎 高捍東

(1. 南京林業(yè)大學林學院，江蘇 南京 210037；2. 黃山學院生命與環(huán)境科學學院，安徽 黃山 245000)

香榧 (Torreyagrandis) 又稱榧子等，是紅豆杉科 (Taxaceae) 榧屬的常綠喬木，雌雄異株，主要生長在浙江、安徽等較為濕潤地區(qū)[1-2]，其樹體枝繁葉茂，姿態(tài)美麗，種子營養(yǎng)豐富，味道香醇，集美容、藥用等功效于一身[3]，是良好的園林樹種和經(jīng)濟樹種。但香榧種子的休眠時間較長且從花芽分化、受精到果實成熟的過程長達三年之久[4]，這極大地阻礙了對香榧的開發(fā)利用。

種子是植物生命中的重要階段，許多自然界中的種子均存在休眠現(xiàn)象，種子中存在內(nèi)源抑制物是導致種子休眠的主要原因之一[5-6]，種子的不同部位均可能存在內(nèi)源抑制物，張茂林等[7]指出杜鵑花 (Rhododendronheamatodes) 種子休眠的主要原因是其種皮中含有內(nèi)源抑制物。白柯君等[8]認為板栗 (Castaneamollissina) 種皮中含有的P-香豆酸可能是抑制種子萌發(fā)的主要原因之一。盧明艷等[9]指出天山鳶尾 (Irisloczyi) 種子的抑制物質(zhì)主要存在于種皮中。GC-MS是用于檢測種子中內(nèi)源物質(zhì)的一種有效方法，張艷杰等[10]利用GC-MS法檢測出南方紅豆杉 (Taxuschinensisvar.mairei) 種子的3個部位均存在某些內(nèi)源物導致種子休眠，蔣玉婷[11]利用GC-MS法鑒定出導致斧翅沙芥 (Pugioniumdolabratum) 種子休眠的主要原因是種子和果皮中含萌發(fā)抑制物質(zhì)。由于內(nèi)源抑制物質(zhì)導致種子休眠的研究在其他植物中也有研究[12-14]，但目前對香榧的研究主要集中于良種選育、栽培等方面[15]，其休眠方面的研究較少[16]。本研究通過萃取液提取香榧種子3種形態(tài)的內(nèi)源物，并對其進行生物測定，分析各萃取液物質(zhì)種類，探討香榧種子內(nèi)源物對其休眠的影響，以期為解除香榧種子深休眠提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香榧種子于2013年10月上旬采集于黃山市黃山區(qū)湯口鎮(zhèn) (海拔300～500 m)，樹齡約120 a。采集后，去除種子的假種皮，水洗干凈、自然干燥后儲藏于4 ℃的冰箱中供試。生物測定使用市售純度為96%、凈度為98%、發(fā)芽率85%以上、含水量約7%的白菜 (Brassicapekinensis) 種子，甲醇、石油醚、乙醚和乙酸乙酯均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1材料初步分離

將供試種子分離為外種皮、內(nèi)種皮、胚乳 (含胚) 3個部位，各取10 g，分別粉碎后參考蔣玉婷等[17]的方法進行初步分離，將得到的石油醚萃取液、乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和甲醇萃取液放入5 ℃的冰箱中備用。

1.2.2內(nèi)源物鑒定

各取3 mL上述石油醚萃取液、乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液及甲醇萃取液，對其進行GC-MS分析。通過質(zhì)譜系統(tǒng)檢索并與標準譜圖進行核對，對GC-MS分析得到的香榧種子3部位各有機相萃取液的總離子流色譜圖進行分析，可得到香榧種子3個部位各有機相萃取液中內(nèi)源物的種類以及相對含量。

GC-MS分析使用氣相-質(zhì)譜連用儀 (Agilent HP7890-5975C)，其載氣為高純He，體積流量設(shè)為1 mL/min；采用HP-5MS彈性石英毛細管柱30 m × 250 μm × 0.25 μm，起始溫度為40 ℃測定3 min，接著用4 ℃/min到160 ℃測定3 min，最后6 ℃/min到285 ℃測定10 min；進樣溫度280 ℃，進樣量1 μL。由計算機控制的庫存信號檢索各個成分的質(zhì)譜圖并參考保留值。

1.2.3內(nèi)源物抑制種子發(fā)芽及生長篩選實驗

在直徑為9 cm墊有濾紙的培養(yǎng)皿中分別加3 mL香榧種子外種皮、內(nèi)種皮和胚乳的各相萃取液，待各相有機溶劑揮發(fā)干后 (水相除外)，加3 mL蒸餾水，并以同體積的蒸餾水作為CK，每個處理重復3次，每個重復100粒白菜種子，放入25 ℃、1 200 lx恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后統(tǒng)計白菜種子的發(fā)芽率 (以露出子葉為發(fā)芽的標準)，72 h后測量其胚根長和苗高。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取液中內(nèi)源物分析

2.1.1石油醚萃取液中內(nèi)源物種類及相對含量分析

由表1可知，香榧種子3個部位石油醚萃取液分別分離出10、11和11種物質(zhì)，選擇離子流色譜圖中峰面積大、質(zhì)譜圖與計算機檢索譜庫圖相似度大、可能對香榧種子發(fā)芽具有抑制作用的內(nèi)源物7、8和8種。其中外種皮中含量較大的為環(huán)己烷、3-甲基己烷、二甲基環(huán)戊烷、甲基環(huán)己烷、未知1、庚烷；內(nèi)種皮中含量較大的為環(huán)己烷、3-甲基己烷、甲基環(huán)己烷、二甲基環(huán)戊烷、1, 2-二甲基環(huán)戊烷、庚烷、未知；胚乳中含量較大的為環(huán)己烷、二甲基環(huán)戊烷、3-甲基己烷、甲基環(huán)己烷、庚烷、1，2-二甲基環(huán)戊烷。可見，香榧種子3個部位石油醚萃取液中的內(nèi)源內(nèi)源物基本都是烷類，其中含量較多的是環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、3-甲基己烷、二甲基環(huán)戊烷、1, 2-二甲基環(huán)戊烷、庚烷。說明香榧種子3個部位內(nèi)源物中含有多種烷類物質(zhì)，而這些烷類物質(zhì)極可能是導致香榧種子休眠的內(nèi)源抑制物，但究竟是哪種物質(zhì)起關(guān)鍵作用還需找到標準品進一步驗證。

表1 香榧種子3個部位石油醚萃取液中內(nèi)源物種類及相對含量Table 1 Compound kinds and their relative content in petroleum ether of 3 parts of T.grandis

2.1.2乙醚萃取液中內(nèi)源物種類及相對含量分析

香榧種子3個部位乙醚萃取液分別分離出1、0和1種物質(zhì)。其中，外種皮和胚乳中僅檢測出2, 6-二叔丁基對甲酚，分子式為C15H24O，分子量為220，含量為100%；內(nèi)種皮乙醚萃取液中未檢測出內(nèi)源物。許多研究提出酚類化合物是種子中抑制作用較強的物質(zhì)，這可能也是外種皮、胚乳乙醚萃取液對白菜種子發(fā)芽率與幼苗生長有抑制作用，而內(nèi)種皮乙醚萃取液對其無明顯抑制作用的原因，說明香榧種子外種皮和胚乳中含有的該種酚類內(nèi)源物極可能是導致其休眠的內(nèi)源抑制物，而該種酚類物質(zhì)對香榧種子的萌發(fā)是否有抑制作用以及抑制作用大小需要找到標準品才能進一步確認。

2.1.3乙酸乙酯萃取液中內(nèi)源物種類及相對含量分析

由表2可知，從香榧種子3個部位乙酸乙酯萃取液,分別分離出2、1和3種物質(zhì)，分子式均為C5H10O2，分子量均為102。其中，外種皮檢測出丙酸乙酯、乙酸丙酯；內(nèi)種皮檢測出丙酸乙酯；胚乳中檢測出丙酸乙酯、醋酸異丙酯、乙酸丙酯?？梢?，香榧種子胚乳中含有一種內(nèi)源物，即醋酸異丙酯，是外種皮和內(nèi)種皮中所不含有的，這可能是香榧種子3部位乙酸乙酯提取物生物測定中胚乳乙酸乙酯提取物對白菜種子發(fā)芽率和幼苗生長抑制作用最強的原因。香榧種子胚乳中所含的醋酸異丙酯極可能為導致香榧種子休眠的內(nèi)源抑制物，但其對香榧種子萌發(fā)的抑制作用大小還需要找到標準品才能進一步確認。

表2 香榧種子3個部位乙酸乙酯萃取液中內(nèi)源物種類及相對含量Table 2 Compound kinds and their relative content in ethyl acetate phase of 3 parts of T.grandis

2.1.4甲醇萃取液中內(nèi)源物種類及相對含量分析

由表3可知，從香榧種子3個部位甲醇萃取液分離出1、39和2種物質(zhì)，分別選擇離子流色譜圖中峰面積較大、質(zhì)譜圖與計算機檢索譜庫圖相似度較大的、可能對香榧種子發(fā)芽具有抑制作用的內(nèi)源物1、11和1種。其中，外種皮僅檢測出環(huán)己烷；內(nèi)種皮中含量較大的為環(huán)己烷、3-甲基己烷；胚乳檢測出鄰苯二酚。此外，內(nèi)種皮中還含有醇類、酸類、烯類、脂類、胺類、醚類及一些未知物質(zhì)的存在。生物測定結(jié)果顯示，種皮甲醇萃取液中所含的烷類物質(zhì)以及胚乳甲醇萃取液中所含的鄰苯二酚對白菜種子的發(fā)芽率和幼苗生長的抑制作用最強，抑制率為100%，說明香榧種子中含有的烷類物質(zhì)和鄰苯二酚極可能是導致香榧種子休眠的內(nèi)源抑制物，其中，鄰苯二酚已被證實是西洋參種子中的萌發(fā)抑制物，而其他烷類物質(zhì)是否抑制種子萌發(fā)以及和種子休眠的關(guān)系還需進一步驗證。

表3 香榧種子3個部位甲醇萃取液中內(nèi)源物種類及相對含量Table 3 Compound kinds and their relative content in methanol extracts of 3 of T.grandis

2.2 內(nèi)源物對白菜種子發(fā)芽和幼苗生長的影響

2.2.1內(nèi)源物對白菜種子發(fā)芽率的影響

由表4可知，與CK相比，外種皮中石油醚、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液處理的白菜種子發(fā)芽率分別減少了9.66%、11.66%和10.45%，用甲醇萃取液處理的白菜種子無一粒發(fā)芽。這說明外種皮內(nèi)源物對白菜種子發(fā)芽均有抑制作用，其中甲醇萃取液中內(nèi)源物對白菜種子抑制作用最大，石油醚萃取液、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液中內(nèi)源物對白菜種子抑制作用幾乎相同。

香榧內(nèi)種皮各萃取液中，用石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液處理的白菜種子發(fā)芽率與CK相比分別減少了4.33%和7.66%，而用乙醚萃取液處理的白菜種子發(fā)芽率比CK多1%，用甲醇萃取液處理的白菜種子無一粒發(fā)芽。這說明內(nèi)種皮石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和甲醇萃取液種內(nèi)源物對白菜種子的發(fā)芽有抑制作用，抑制作用大小為甲醇萃取液內(nèi)源物 > 乙酸乙酯萃取液內(nèi)源物 > 石油醚萃取液中內(nèi)源物，而乙醚萃取液內(nèi)源物對白菜種子的萌發(fā)無抑制影響。

香榧胚乳各萃取液中，用石油醚萃取液、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液處理白菜種子發(fā)芽率與CK相比分別減少13%、24.33%和68.33%，用甲醇萃取液處理的白菜種子無一粒發(fā)芽。這說明胚乳各萃取液中內(nèi)源物對白菜種子萌發(fā)均有抑制作用，抑制作用大小分別為甲醇萃取液中內(nèi)源物 > 乙酸乙酯萃取液中內(nèi)源物 > 乙醚萃取液中內(nèi)源物 > 石油醚萃取液中內(nèi)源物。

方差分析結(jié)果 (表4) 表明，除了內(nèi)種皮乙醚萃取液對白菜種子發(fā)芽率的影響不顯著外，其他各項均存在顯著 (P< 0.05) 或極顯著差異 (P< 0.01)，這說明外種皮、內(nèi)種皮和胚乳中均存在抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)。外種皮、內(nèi)種皮和胚乳的不同相態(tài)對白菜種子發(fā)芽率抑制作用不同的原因可能是香榧種子外種皮、內(nèi)種皮和胚乳的不同相態(tài)萃取液中含有的抑制物質(zhì)不同或所含抑制物質(zhì)濃度不同。

2.2.2內(nèi)源物對白菜幼苗胚根長的影響

香榧種子3個部位萃取液處理白菜幼苗胚根長存在不一致性，結(jié)果如表4。外種皮中石油醚萃取液、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液處理白菜幼苗胚根長分別為35.71、35.11 mm和31.48 mm，均小于CK。香榧種子內(nèi)種皮中石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液處理白菜幼苗胚根長分別36.03 mm和38.75 mm，小于CK，乙醚萃取液處理的白菜幼苗胚根長為41.04 mm，略大于CK。香榧種子胚乳中石油醚萃取液、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液處理白菜幼苗胚根長分別為38.85、24.62 mm和15.18 mm，均小于CK。方差分析結(jié)果 (表4) 表明，與CK相比，胚乳石油醚萃取液、內(nèi)種皮乙酸乙酯萃取液對白菜幼苗胚根長無顯著差異外，其他各指標之間均存在顯著 (P< 0.05) 或極顯著差異 (P< 0.01)?？梢?，除了胚乳石油醚萃取液、內(nèi)種皮乙酸乙酯萃取液中內(nèi)源物對白菜幼苗胚根生長無影響外，外種皮、內(nèi)種皮和胚乳的其他各萃取液中均存在影響胚根生長的物質(zhì)。

表4 香榧3個部位內(nèi)源物對白菜種子發(fā)芽率及幼苗生長的影響Table 4 Effects of the extract from 3 parts of T.grandis seed on the percentage germination and seedling growth of B.pekinensis seedlings

注：不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著。

2.2.3香榧種子各部分內(nèi)源物對白菜幼苗苗高的影響

香榧種子的3個部位萃取液處理的白菜幼苗苗高存在不同，結(jié)果如表4。外種皮中石油醚萃取液、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液處理白菜幼苗苗高分別為12.24、12.09 mm和12.76 mm，與CK差距不大。香榧種子內(nèi)種皮中石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液處理白菜幼苗苗高分別為11 mm和11.65 mm，均小于CK，乙醚萃取液處理的白菜幼苗苗高為12.29 mm，與CK基本相同。香榧種子胚乳中石油醚萃取液、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液處理白菜幼苗苗高分別為11.34、9.14 mm和8.76 mm，均小于CK。方差分析結(jié)果 (表4) 表明，與CK相比，外種皮石油醚萃取液、乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和內(nèi)種皮乙醚萃取液對白菜幼苗苗高生長作用無明顯差異外，其他各指標之間均存在顯著 (P< 0.05) 或極顯著差異 (P< 0.01)。

3 結(jié)論與討論

自然狀態(tài)下的香榧種子存在一定的深休眠性，即使給予適宜的水分和溫度條件，經(jīng)歷一段時間仍不能正常萌發(fā)。Kentzen[5]和Li等[6]曾指出種子中存在抑制物質(zhì)是影響種子休眠的主要原因之一。

本實驗以白菜種子為指示植物，萃取出香榧種子3個部位的內(nèi)源物，并對其進行了生物測定。香榧種子3個部位萃取液對白菜種子的發(fā)芽率和幼苗生長均存在不同程度的影響，其中3個部位甲醇萃取液處理白菜種子無一粒發(fā)芽，抑制作用最強，抑制率達到100%，說明香榧種子3個部位甲醇萃取液中均含有某些萌發(fā)抑制物質(zhì)，對種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用最強，這與張艷杰等[18]的研究結(jié)果一致。對各萃取液抑制作用進行比較，胚乳各萃取液對白菜種子發(fā)芽率和幼苗生長抑制作用強弱程度依次為甲醇萃取液 > 乙酸乙酯萃取液 > 乙醚萃取液 > 石油醚萃取液，且胚乳各萃取液對白菜種子發(fā)芽率和幼苗生長的影響均與CK存在顯著 (P< 0.05) 或極顯著差異 (P< 0.01)，這說明香榧種子胚乳中存在抑制其萌發(fā)的物質(zhì)，這與張翔宇等[19]對大花黃牡丹種子休眠原因的研究結(jié)果一致。

外種皮各萃取液對白菜種子發(fā)芽率抑制作用強弱程度依次為甲醇萃取液 > 乙醚萃取液 > 乙酸乙酯萃取液 > 石油醚萃取液，外種皮各萃取液對白菜種子胚根長抑制作用強弱程度依次為甲醇萃取液 > 乙酸乙酯萃取液 > 乙醚萃取液 > 石油醚萃取液。而外種皮各乙酸乙酯萃取液、乙醚萃取液、石油醚萃取液對白菜幼苗苗高的影響與CK相比無顯著影響，說明除了甲醇萃取液中存在明顯抑制白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的物質(zhì)，其他萃取液對白菜種子發(fā)芽率和幼苗胚根生長的抑制作用較弱，對白菜幼苗的苗高生長無明顯抑制作用。

內(nèi)種皮各萃取液對白菜種子發(fā)芽率抑制作用強弱程度依次為甲醇萃取液 > 乙酸乙酯萃取液 > 石油醚萃取液，內(nèi)種皮各萃取液對白菜幼苗生長抑制作用強弱程度依次為甲醇萃取液 > 石油醚萃取液 > 乙酸乙酯萃取液，說明內(nèi)種皮甲醇萃取液、乙酸乙酯萃取液、石油醚萃取液均存在抑制其萌發(fā)的物質(zhì)，而內(nèi)種皮乙醚萃取液萃取液處理的白菜種子的發(fā)芽率、幼苗的苗高和胚根生長均高于CK，說明內(nèi)種皮乙醚萃取液中可能存在促進白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的物質(zhì)，但是具體哪種物質(zhì)起作用還需進行進一步的研究。

GC-MS檢測結(jié)果表明，從香榧種子的外種皮、內(nèi)種皮和胚乳中檢測出多種內(nèi)源物，主要物質(zhì)有烷類、酚類、醇類、酸類等。其中，外種皮和胚乳的乙醚萃取液中含有2, 6-二叔丁基對甲酚，含量為100%，而胚乳中不含該物質(zhì)，說明2, 6-二叔丁基對甲酚極可能是導致香榧種子休眠的抑制物質(zhì)；外種皮和胚乳的石油醚萃取液中的二甲基環(huán)戊烷含量較高，均大于13%，而胚乳中含量較低，為9.41%，說明該物質(zhì)的含量可能與香榧種子的休眠有關(guān)；胚乳的甲醇萃取液浸提液中檢測出鄰苯二酚，其抑制作用已被證實是西洋參種子中的發(fā)芽抑制物質(zhì)[20]，其他物質(zhì)的是否抑制種子萌發(fā)以及和種子休眠的關(guān)系還需進一步研究。

生物測定結(jié)果表明，外種皮和胚乳中的內(nèi)源物對香榧種子萌發(fā)的抑制作用較強，而內(nèi)種皮中的內(nèi)源物對香榧種子萌發(fā)的抑制作用較弱，年慧慧等[21]研究指出影響南方紅豆杉萌發(fā)的主要原因之一是外種皮和胚乳中含有抑制物質(zhì)，其與本研究的結(jié)果存在一致性。

綜上所述，研究初步確定香榧種子3個部位中存在抑制物質(zhì)是導致其種子休眠的重要原因之一，其中鄰苯二酚的抑制活性已在西洋參種子中被前人證明，其他物質(zhì)的抑制作用及與香榧種子休眠的關(guān)系還需要進一步研究，從而為打破香榧種子的休眠提供理論依據(jù)。

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