發(fā)酵條件對5種產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵和產(chǎn)酯的影響

邢 爽，王亞平，郭學(xué)武，魏志陽，孫中貫，肖冬光*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457）

白酒是我國傳統(tǒng)的蒸餾酒，歷史悠久。白酒中的風(fēng)味物質(zhì)包括酸、酯、醇、醛和其他五大類，其中酯類物質(zhì)所占比例最大。在各種香型白酒中，乙酸乙酯是分布最廣泛的一種酯類物質(zhì)，尤其是對清香型、老白干香型、鳳香型等白酒，乙酸乙酯是構(gòu)成其主體香味成分的重要物質(zhì)[1-3]。

產(chǎn)酯酵母又稱為生香酵母，是指產(chǎn)酯能力強的酵母菌總稱，主要產(chǎn)乙酸乙酯，多屬于產(chǎn)膜酵母，包括假絲酵母、漢遜酵母、畢赤酵母、球擬酵母等。在白酒生產(chǎn)中，其參與釀造發(fā)酵，是形成白酒香味成分的主要菌群[4-6]。產(chǎn)酯酵母的應(yīng)用與相關(guān)研究始于20世紀(jì)60年代，張宏偉等[7]將培養(yǎng)成熟的產(chǎn)酯酵母拌入酒醅中蒸餾，既不影響正常酒率，又能明顯增香；宋玉華等[8]在清香酒生產(chǎn)中添加固體產(chǎn)酯酵母入池發(fā)酵，乙酸乙酯含量明顯提高，且酒質(zhì)甘爽余味長，清香風(fēng)格明顯；劉桂君等[9]在液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)白酒時用生香酵母與紅曲、釀酒酵母共同發(fā)酵，所獲白酒乙酸乙酯的含量有較大幅度提高，酒的口味和香氣均有改善。

酵母菌的酒精發(fā)酵和產(chǎn)酯與很多因素有關(guān)，包括發(fā)酵培養(yǎng)基、溫度、pH、供氧情況等。釀酒酵母屬兼性厭氧菌，可在無氧條件下生長與代謝，而大多數(shù)生香酵母則需在有氧條件下生長代謝[10]。王瑞明等[11]的研究表明，氧氣對異漢遜酵母酯類代謝起著很重要的作用。目前關(guān)于供氧情況對產(chǎn)酯酵母影響的研究較少，且白酒生產(chǎn)中發(fā)酵溫度和pH是極為重要的發(fā)酵條件，直接影響優(yōu)質(zhì)白酒的生產(chǎn)，因此研究供氧情況、pH、溫度對產(chǎn)酯酵母的具體影響，對于產(chǎn)酯酵母在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用是有必要的，且對于白酒生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。鑒于此，本實驗擬對白酒廠中常用的幾種產(chǎn)酯酵母一同進行研究，探究供氧情況、pH和溫度對其酒精發(fā)酵和產(chǎn)酯的影響，以了解各種產(chǎn)酯酵母在不同發(fā)酵條件下酒精發(fā)酵和代謝產(chǎn)酯的規(guī)律，為產(chǎn)酯酵母在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

卡特多菲畢赤酵母（Pichia cactophila）、克魯斯假絲酵母（Candida krusei）、漢遜酵母（Hansenula anomala）、球擬酵母（Torulopsis globosa）：工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室保存。

高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15（CGMCC No.5635）：本研究室選育，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室保存。

1.1.2 原料與主要試劑

澳洲高粱：由某酒廠提供；乙酸乙酯、乙醇（色譜級）：天津市光復(fù)精細化工研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：玉米水解液，pH自然，調(diào)節(jié)糖度至12°Bx，108℃高壓蒸汽滅菌10 min，備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：高粱水解液，調(diào)糖度至12°Bx，115℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

Sever Easy型pH計：瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀、1260 Infinity型高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 供氧情況對產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵和產(chǎn)酯的影響

250 mL錐形瓶中分別添加100 mL、150 mL、200 mL、250mL發(fā)酵培養(yǎng)基（pH自然（6.7）），酵母接種量5×106CFU/mL。其中裝液量100 mL的錐形瓶采用紗布和膠塞（膠塞中央插一9號針頭，用于排氣）兩種封口方式，其余裝液量的錐形瓶都采用膠塞封口。在相同的錐形瓶內(nèi)，裝液量的多少反映了供氧的強弱，其中裝液量100 mL、紗布封口為供氧最充足的，裝液量250 mL、膠塞封口供氧相對最少。發(fā)酵溫度28℃，根據(jù)各種酵母菌發(fā)酵速度的不同（卡特多菲畢赤酵母和克魯斯假絲酵母發(fā)酵4 d、漢遜酵母發(fā)酵3.5 d、球擬酵母發(fā)酵3 d、高產(chǎn)酯釀酒酵母發(fā)酵1 d）。發(fā)酵完畢測定樣品的酒精度、發(fā)酵度和乙酸乙酯含量。

1.3.2 發(fā)酵pH對產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵和產(chǎn)酯的影響

設(shè)置發(fā)酵pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、pH自然（6.7），裝液量100 mL，紗布封口；其他條件同上。

1.3.3 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵和產(chǎn)酯的影響

設(shè)置發(fā)酵溫度分別為20℃、24℃、28℃、30℃、32℃、36℃，pH自然（6.7），其他條件同上。

1.3.4 測定方法

（1）酒精度的測定：取100 mL發(fā)酵液于蒸餾瓶中，加入100 mL水蒸餾，收集100 mL餾出液，用酒精計法測定[12]。

（2）乙酸乙酯的測定：采用氣相色譜外標(biāo)法檢測，色譜柱采用Agilent HP-INNOWAX（30 m×320 μm×0.25 μm），載氣為高純氮氣（＞99.999%）；柱流速為0.8 mL/min；進樣口溫度200℃；檢測器溫度150℃；程序升溫：起始溫度50℃，保持8 min，以5℃/min升至150℃，保持15 min；進樣體積為1 μL；分流進樣，分流比為10∶1[13]。

（3）發(fā)酵度：采用高效液相色譜測定發(fā)酵前后培養(yǎng)液含糖量[14]，條件為采用HPX-87H（300 mm×7.8 mm×9 μm）的液相色譜柱，二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD），流動相為0.005 mol/L硫酸溶液，柱溫65℃，流速為0.6 mL/min，檢測時間23 min，進樣量為20 μL。發(fā)酵度計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 供氧情況對產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵和產(chǎn)酯的影響

供氧情況對產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵的影響見圖1。由圖1可知，供氧情況對卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母、漢遜酵母、球擬酵母的酒精發(fā)酵均有顯著影響，供氧不足時酵母酒精發(fā)酵受抑制，酒精度明顯下降。裝液量250 mL時卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母、漢遜酵母、球擬酵母的酒精度分別為有氧發(fā)酵（100 mL，紗布）的22.7%、15.3%、27.2%、30.9%，而高產(chǎn)酯釀酒酵母無影響（102.7%）。

供氧情況對產(chǎn)酯酵母發(fā)酵度的影響見圖2。由圖2可知，隨著供氧量的減少，產(chǎn)酯酵母的發(fā)酵度降低，變化顯著。裝液量250 mL時卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母、漢遜酵母、球擬酵母的發(fā)酵度分別為26.2%、17.2%、33.5%、30.4%，而高產(chǎn)酯釀酒酵母在各供氧情況下發(fā)酵度均保持在94%以上。說明供氧不足的情況下，卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母、漢遜酵母和球擬酵母不能正常發(fā)酵。

圖2 供氧情況對產(chǎn)酯酵母發(fā)酵度的影響Fig.2 Effect of oxygen supply on fermentation degree of ester-producing yeast

圖3 供氧情況對產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯的影響Fig.3 Effect of oxygen supply on ester production of ester-producing yeast

供氧情況對產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯的影響見圖3。由圖3可知，膠塞封口發(fā)酵條件下，隨著裝液量的增加，產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯量下降。裝液量100 mL，兩種封口方式比較來看，卡特多菲畢赤酵母和克魯斯假絲酵母膠塞封口下產(chǎn)酯多，漢遜酵母兩種方式產(chǎn)酯相當(dāng)，而球擬酵母和高產(chǎn)酯釀酒酵母紗布產(chǎn)酯高，尤其是球擬酵母。裝液量250 mL時卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母、漢遜酵母、球擬酵母、高產(chǎn)酯釀酒酵母的乙酸乙酯含量分別為有氧發(fā)酵（100 mL，紗布）的57.7%、69.4%、68.8%、6.7%、106.3%，說明相對厭氧情況下對球擬酵母產(chǎn)酯的影響最大，對卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母、漢遜酵母的產(chǎn)酯有顯著影響，而高產(chǎn)酯釀酒酵母在厭氧嚴格時產(chǎn)酯稍有提高。說明供氧情況對各種產(chǎn)酯酵母的影響程度由大到小分別是球擬酵母＞卡特多菲畢赤酵母＞漢遜酵母＞克魯斯假絲酵母＞高產(chǎn)酯釀酒酵母。

2.2 發(fā)酵pH對產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵與產(chǎn)酯的影響

發(fā)酵pH對產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵的影響見圖4。由圖4可知，pH對各種產(chǎn)酯酵母的產(chǎn)酒均有一定影響，其中卡特多菲畢赤酵母的最適pH為5.0，克魯斯假絲酵母和漢遜酵母最適pH為4.0，球擬酵母最適pH為6.0～7.0，高產(chǎn)酯釀酒酵母在pH4.0～7.0范圍內(nèi)對產(chǎn)酒無明顯影響。

圖4 發(fā)酵pH對產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of fermentation pH on ethanol fermentation of ester-producing yeast

發(fā)酵pH對產(chǎn)酯酵母發(fā)酵度的影響見圖5。由圖5可知，pH對球擬酵母發(fā)酵度影響最大，低pH條件下（4.0～5.0）發(fā)酵度低，其次是克魯斯假絲酵母和漢遜酵母，較高pH條件下（6.0～7.0）發(fā)酵度稍低，在pH4.0～7.0范圍內(nèi)對卡特多菲畢赤酵母和高產(chǎn)酯釀酒酵母基本無影響。

圖5 發(fā)酵pH對產(chǎn)酯酵母發(fā)酵度的影響Fig.5 Effect of fermentation pH on fermentation degree of ester-producing yeast

發(fā)酵pH對產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯的影響見圖6。由圖6可知，pH對各種產(chǎn)酯酵母的產(chǎn)酯均有一定的影響，其中卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母、漢遜酵母和球擬酵母的最適pH均為6.7，在pH4.0時產(chǎn)酯最差，乙酸乙酯含量分別下降了62.8%、56.2%、46.1%和30.0%；pH對高產(chǎn)酯釀酒酵母的影響相對較小，pH6.0～7.0為pH最適范圍，因此發(fā)酵pH對產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯影響程度由大到小依次是卡特多菲畢赤酵母＞克魯斯假絲酵母＞漢遜酵母＞球擬酵母＞高產(chǎn)酯釀酒酵母。

圖6 發(fā)酵pH對產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯的影響Fig.6 Effect of fermentation pH on ester production of ester-producing yeast

2.3 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵與產(chǎn)酯的影響

發(fā)酵溫度對產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵的影響見圖7。由圖7可知，溫度對各種產(chǎn)酯酵母的酒精發(fā)酵均有不同程度的影響，其中卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母、漢遜酵母和球擬酵母的最適產(chǎn)酒溫度均為28℃，20℃時酒精度最低，相比28℃時酒精度分別下降了29.2%、62.1%、21.9%、71.0%，由此看出，溫度對球擬酵母產(chǎn)酒的影響最大，其次是克魯斯假絲酵母，最后是卡特多菲畢赤酵母和漢遜酵母。溫度對高產(chǎn)酯釀酒酵母的影響相對較小，且與上述4種產(chǎn)酯酵母不同，溫度較低時產(chǎn)酒稍高。

圖7 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on ethanol fermentation of ester-producing yeast

發(fā)酵溫度對產(chǎn)酯酵母發(fā)酵度的影響見圖8。由圖8可知，溫度對卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母、漢遜酵母和球擬酵母的發(fā)酵度均有明顯影響，溫度低于28℃時發(fā)酵速度緩慢，發(fā)酵度低，卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母、漢遜酵母和球擬酵母在溫度28～36℃范圍內(nèi)發(fā)酵正常；溫度對高產(chǎn)酯釀酒酵母的影響相對較小，溫度在20～36℃范圍內(nèi)發(fā)酵均正常。

圖8 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酯酵母發(fā)酵度的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on fermentation degree of ester-producing yeast

發(fā)酵溫度對產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯的影響見圖9。由圖9可知，溫度對各種產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯的影響較大，其中卡特多菲畢赤酵母的最適溫度為20℃，克魯斯假絲酵母、漢遜酵母和高產(chǎn)酯釀酒酵母的最適溫度為24℃，球擬酵母的最適溫度為28℃。球擬酵母在20℃時產(chǎn)酯最差，相比28℃時產(chǎn)酯量下降了72.2%；其他4種酵母均在36℃時產(chǎn)酯最差，相比各酵母最適溫度條件下的產(chǎn)酯量分別下降91.3%、89.6%、90.3%、54.7%。從而得出溫度對各種產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯影響的大小依次為：卡特多菲畢赤酵母＞漢遜酵母＞克魯斯假絲酵母＞球擬酵母＞高產(chǎn)酯釀酒酵母。

圖9 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on ester production of ester-producing yeast

3 結(jié)論

供氧情況、發(fā)酵pH和溫度對白酒生產(chǎn)常用產(chǎn)酯酵母菌（卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母、漢遜酵母和球擬酵母）的酒精發(fā)酵和產(chǎn)酯有明顯影響，其中供氧不足時對酒精發(fā)酵和產(chǎn)酯的影響最大，pH低、溫度高時產(chǎn)酯下降明顯。除高溫對產(chǎn)酯有一定影響外，在本實驗所選發(fā)酵條件范圍內(nèi)高產(chǎn)酯釀酒酵母的酒精發(fā)酵和產(chǎn)酯無明顯變化，說明高產(chǎn)酯釀酒酵母具有廣泛的適應(yīng)性。

眾所周知，白酒發(fā)酵過程是在厭氧和低pH環(huán)境下進行的，卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母、漢遜酵母和球擬酵母等白酒生產(chǎn)中常用的產(chǎn)酯酵母直接入池發(fā)酵對白酒增酯效果不明顯。如果將這些酵母在池外單獨培養(yǎng)，在適合酵母的產(chǎn)酯條件下制備成酯化液或固態(tài)香醅，然后再入池發(fā)酵或與池內(nèi)酒醅混蒸，即可有效提高成品酒中的酯含量。對于小曲白酒、芝麻香型白酒、醬香型白酒，由于其生產(chǎn)工藝中有堆積培菌過程環(huán)節(jié)，而此過程是有氧的，如果在堆積培菌前接入這些產(chǎn)酯酵母與傳統(tǒng)糖化發(fā)酵劑協(xié)同糖化發(fā)酵，同樣可明顯提高酯含量。高產(chǎn)酯釀酒酵母由于具有廣泛的適應(yīng)性，其應(yīng)用方式不受限制，既可池外培養(yǎng)后入池發(fā)酵，也可直接入池發(fā)酵。此外，各種產(chǎn)酯酵母的最適產(chǎn)酯溫度都在28℃以內(nèi)，溫度高時產(chǎn)酯能力明顯下降。

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