烏克蘭鱗鯉丙酮酸激酶基因全長cDNA克隆及組織表達分析

方珍珍,段霽航,程鎮(zhèn)燕,孫金輝,白東清,喬秀亭

(天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

丙酮酸羧激酶(PK)屬于丙酮酸激酶超家族的一員，它是糖酵解過程中第三個限速酶，即催化糖酵解最后一步的關鍵酶：在鉀離子和鎂離子參與下，丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸和二磷酸腺苷轉(zhuǎn)化成丙酮酸和三磷酸腺苷。此反應在生理條件下是不可逆的，其產(chǎn)物丙酮酸可參與多種代謝途徑，因此丙酮酸羧激酶在許多需要丙酮酸參與的代謝途徑中的作用非常重要。

近年，各種提高魚類生長率的方法逐步發(fā)展起來[1-2]。因此，研究者們轉(zhuǎn)而研究與肌肉生長有關的基因。Johansen等[3]在對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)禁食中觀察到它與肌肉生長有關的基因表達量大量降低。Ohta等[4]在禁食的魚體中發(fā)現(xiàn)，某些與三磷酸腺苷代謝相關的基因表達量和與肌肉發(fā)育相關的基因表達量兩者一起提高，但是前者有更為顯著的提高，此現(xiàn)象說明饑餓等生理狀態(tài)會造成三磷酸腺苷代謝信號通路和肌肉發(fā)育的信號通路更為敏感，但前者比后者更為敏感。丙酮酸激酶能夠使磷酸烯醇式丙酮酸和二磷酸腺苷反應產(chǎn)生三磷酸腺苷，所以為了調(diào)節(jié)魚類生長，研究丙酮酸激酶基因表達變化的意義重大。

烏克蘭鱗鯉(Cyprinuscarpoio)屬于鯉形目、鯉科、鯉亞科、鯉屬，是經(jīng)過綜合科學選育而成的優(yōu)良品種，已經(jīng)在莫斯科地區(qū)的漁場進行大量養(yǎng)殖。1998年全國水產(chǎn)技術推廣總站從俄羅斯引進，國家級天津市換新水產(chǎn)良種場經(jīng)強化培育和選種，生長較快，具有豐富的遺傳多樣性。2005年經(jīng)全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定，農(nóng)業(yè)部批準在全國推廣養(yǎng)殖。該品種已在天津、河北、遼寧、黑龍江等省部分地區(qū)進行了生產(chǎn)性對比養(yǎng)殖試驗,增產(chǎn)效果顯著。目前針對烏克蘭鱗鯉營養(yǎng)與飼料方面，高妍等[5]研究了不同水平白藜蘆醇對烏克蘭鱗鯉消化酶及非特異性免疫指標的影響，梁愛軍等[6]利用水平式淀粉凝膠電泳法對46尾烏克蘭鱗鯉進行了AAT、α-GPD、GPI、IDH、MDH和PGM共6種同工酶以及肌漿蛋白進行了電泳分析；但是在分子營養(yǎng)學方向，針對烏克蘭鱗鯉的研究當前尚是空白。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

健康試驗魚取自天津市換新水產(chǎn)良種場同一批繁殖的魚種，平均體質(zhì)量(20±2) g，平均體長為10 cm，隨后運往天津農(nóng)學院。進行消毒處理后在實驗室進行暫養(yǎng)，試驗期間水溫控制在(30±2) ℃，溶氧量>6 mg/L，pH為7.2，氨氮<0.5 mg/L，養(yǎng)殖箱24 h連續(xù)曝氣，日投喂2次，日換水1/3～1/2，用虹吸法吸去排泄物。

每日9：00分別向兩箱魚種投喂低糖飼料，使其適應7 d，然后禁食1 d，次日9：00分別投喂低糖、高糖飼料，15：00開始取樣。將烏克蘭鱗鯉肝胰臟、腦、腎臟、心臟、肌肉取出，提取RNA。

低糖飼料各原料的質(zhì)量分數(shù)：魚粉8%，豆粕15%，花生粕16%，棉粕8%，菜粕10%，干酒糟高蛋白3%，豆油4%，預混料1%，微晶纖維素25%，麩皮10%，糊精0。

高糖飼料各原料的質(zhì)量分數(shù)：魚粉8%，豆粕15%，花生粕16%，棉粕8%，菜粕10%，干酒糟高蛋白3%，豆油4%，預混料1%，微晶纖維素0，麩皮10%，糊精25%。

1.2 試劑

RNAisoPlus、PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit、3’-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase、TaKaRa LA Taq購自寶生物工程(大連)有限公司；pGEM-T克隆載體購自普洛麥格生物技術(北京)有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α由本校重點實驗室提供。其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。試驗所用引物均由蘇州金唯智生物科技(北京)有限公司合成。

1.3 烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因全長序列的克隆

取禁食后烏克蘭鱗鯉肝胰臟組織，采用Trizol-酚-氯仿法提取肝胰臟總RNA，檢索已知魚類的丙酮酸羧激酶的基因序列，在該序列的中間位置的保守區(qū)應用相同原理設計一對具有簡并性的上、下游引物。擴增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

切膠回收目的片段后連接到pGEM-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，藍白斑篩選陽性克隆，菌液PCR檢測陽性克隆，提取質(zhì)粒后送蘇州金唯智生物科技(北京)有限公司測序。

根據(jù)測序驗證后的部分序列設計RACE引物，擴增丙酮酸羧激酶的cDNA的5′和3′末端。PCR反應程序為94 ℃ 30 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 3 min，30個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。切膠回收目的片段后連接到pGEM-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，藍白斑篩選陽性克隆，菌液PCR檢測陽性克隆，按照試劑盒說明書要求5′末端挑取8個陽性克隆，3′端挑取5個陽性克隆，提取質(zhì)粒后送蘇州金唯智生物科技(北京)有限公司測序。本試驗所用引物序列見表1。

表1 引物

1.4 序列分析

使用DNAStar軟件中的EditSeq程序?qū)蹩颂m鱗鯉丙酮酸羧激酶基因中間序列、3′端序列和5′端序列的核苷酸數(shù)據(jù)使用軟件將其按順序拼接起來，得到烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因全長cDNA序列。使用DNAStar軟件中的EditSeq程序進行開放閱讀框的查詢，并對基因進行翻譯，同時對蛋白等電點和分子量進行預測。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast工具進行同源性序列搜索，在NCBI數(shù)據(jù)庫的Conserved Domain Search上完成活性位點及結構域的預測。

1.5 烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因在各組織中表達

取低糖組、高糖組烏克蘭鱗鯉活體解剖，快速分離肝臟、腦、腎臟、心臟、肌肉和腸等組織，分別提取總RNA，1%變性瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。用PK-F與PK-R為引物進行RT-PCR擴增，同時以β-actin為內(nèi)標，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 烏克蘭鱗鯉肝胰臟總RNA的制備

肝胰臟總RNA的制備按照TaKaRa RNAisoPlus試劑的說明書進行，經(jīng)過1%瓊脂糖電泳檢測，可以看到RNA亮度高，28S條帶的亮度約為18S條帶亮度的2倍(圖1)，并且條帶清晰，說明本試驗制備的RNA質(zhì)量合格，可以進行后續(xù)試驗。

2.2 烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因的克隆

以烏克蘭鱗鯉正常的肝胰臟組織提取的RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA為模板，以PK-F1和PK-R1為引物，PCR得到約800 bp的中間序列(圖2)，克隆測序后得822 bp的丙酮酸羧激酶的基因序列，以得到的序列片段為模板設計3′端引物PK-3′ F，得到約1000 bp的3′端序列(圖3)，克隆測序后為902 bp，并根據(jù)中間序列為模板設計5′端引物PK-5′R，PK-5′NR，PCR得到約500 bp的5′端序列(圖4)，克隆測序后為514 bp。經(jīng)拼接后得烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因全長序列，其總長為1913 bp，其中開放閱讀框1617 bp，翻譯539個氨基酸，預測分子質(zhì)量為58.72 ku，等電點為6.57，3′非翻譯區(qū)長154 bp及多聚腺苷酸尾巴，5′非翻譯區(qū)長143 bp。

圖1 烏克蘭鱗鯉肝胰臟組織總RNA1%瓊脂糖凝膠電泳M為DL2000 DNAmarker；1為總RNA.

圖2 丙酮酸羧激酶中間片段PCR結果M為DL2000 DNAMarker；1為目的片段.

圖3 PK5’端和3’端PCR結果M為DL5000 DNAMarker；1為目的片段.

2.3 烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因的核苷酸組成及推導的氨基酸序列

將各片段的測序結果拼接后，得到烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因全長序列(圖5)，接下來推導出它的氨基酸序列(圖6)。

本試驗自烏克蘭鱗鯉肝胰臟中分離到了丙酮酸羧激酶基因的cDNA全序列，其開放閱讀框長度為1617 bp，共翻譯538個氨基酸，預測分子質(zhì)量為58.72 ku，等電點為6.57。

其中，其氨基酸序列有活性位點1個，其范圍包括Arg79和Asn81、Asp119、Phe251、Lys277和Glu279、Asp303、Thr335；其結構域邊界包括Asn51和Thr52，Pro113，Ala115，Pro123至Arg126，Val215和Asn216，Val223，Pro226至Asp230，Asp245，Arg253，Ala260，Asn271，Glu307，Asn325和Ser326，Pro330，Gly362，Asp364，Glu393，Ala395和lle396，Arg450，Arg452，Arg454，Gln465，Arg468和Gln469，Gln471，Gln473，Leu475至Gly477。

由NCBI數(shù)據(jù)庫中搜集了斑馬魚(Daniorerio)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)等6種生物丙酮酸羧激酶的氨基酸序列，使用DNAStar中的MegAlign 工具，用Clustal W方法構建了系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)烏克蘭鱗鯉與草魚的親緣關系最接近，其次為斑馬魚和綠河鲀(Tetraodonnigroviridis)(圖7)。

2.4 烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因各組織的表達

采用半定量RT-PCR方法對丙酮酸羧激酶基因在肝胰臟、腦、腎臟、心臟、肌肉、腸道等組織的表達進行研究。結果表明，低糖組丙酮酸羧激酶基因在各組織中均有表達，在肝胰臟、腦和心臟中表達較豐富；高糖組丙酮酸羧激酶基因在肝胰臟、腦、腎臟和腸道中有明顯表達，其中在肝胰臟和腦中的表達量較豐富，在心臟和肌肉中的表達很微弱(圖8～圖10)。

圖4 丙酮酸羧激酶的核苷酸序列右邊數(shù)字代表核苷酸編號；閱讀框1617 bp，用三聯(lián)碼表示；加尾信號用紅色邊框表示.

圖5 丙酮酸羧激酶所編碼的氨基酸序列

圖6 丙酮酸羧激酶的各結合位點

圖7 烏克蘭鱗鯉與部分已知物種的丙酮酸羧激酶系統(tǒng)進化樹

圖8 低糖組和高糖組半定量PCR結果

圖9 低糖組各組織PK表達情況

圖10 高糖組各組織PK表達情況

3 討 論

3.1 烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因的序列分析

烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因的核苷酸序列5′端非翻譯區(qū)長度為142 bp，草魚(JQ951928.1)為1 bp，斑馬魚(NM201289.1)為32 bp；該酶的3′端非翻譯區(qū)長度為154 bp，草魚為180 bp，斑馬魚為158 bp。

由于在脊椎動物中，丙酮酸羧激酶的同工酶分為四種，分別為M1型、M2型、L型、R型[7-8]。M1型分布于心肌、骨骼肌和腦組織；M2型分布于腦及肝臟等組織[9]。本試驗所得的丙酮酸羧激酶基因是從烏克蘭鱗鯉肝胰臟中克隆的，因此，可以推斷出該酶可能屬于M2型同工酶。

丙酮酸羧激酶的作用催化磷酸烯醇式丙酮酸和二磷酸腺苷轉(zhuǎn)化成丙酮酸和三磷酸腺苷，該反應是放能反應。由圖6可見，該酶沒有三磷酸腺苷結合位點，這印證了該酶在行使其催化功能時不需要三磷酸腺苷的水解供應其能量。

烏克蘭鱗鯉與草魚、斑馬魚和綠河鲀該酶的氨基酸序列在分子結構上均包含1個活性位點和1個結構域邊界，各自氨基酸序列上的位置基本一致。

3.2 丙酮酸羧激酶基因組織表達

由圖9～圖10可見，烏克蘭鱗鯉在禁食48 h后，其各組織丙酮酸羧激酶基因的表達水平。丙酮酸羧激酶除在肝胰臟和腎臟中表達水平較高外，還在腸道中表達得較為活躍。這與Pilkis等[10]的研究結果不同，他們發(fā)現(xiàn)在饑餓狀態(tài)下，丙酮酸羧激酶的表達量下降。這個結果表明，烏克蘭鱗鯉在饑餓的情況下，機體糖異生所產(chǎn)生的少量丙酮酸會立即進入糖酵解過程，轉(zhuǎn)化為能量供給魚類的生理活動。烏克蘭鱗鯉在進食碳水化合物含量較低的飼料6 h后，其各組織的丙酮酸羧激酶基因的表達水平。丙酮酸羧激酶基因在各組織中均有表達，在肝臟、腦、心臟中表達較豐富，以肝胰臟最多，這與肖玲[11]對松江鱸(Trachidermusfasciatus)丙酮酸羧激酶基因的研究結果基本一致，與Chen等[12]對草魚丙酮酸羧激酶基因的研究結果一致，與Panserat等[13]對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究結果相同，與Knox等[14]對鱈魚(Gadusmorhua)、歐鰈(Pleuronectesplatessa)的研究結果部分相同，在心臟、腦中含量高，在肝胰臟、腎中相對較低。糖酵解的相關基因丙酮酸羧激酶在肝胰臟、腦、腎臟、腸道中有表達，這也從一個側面說明當時烏克蘭鱗鯉的血糖水平相對較高。

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