頸盲蝽取食對(duì)薇甘菊葉片營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和防御酶的影響

李 勝， 鄭端靖， 王 尹， 林 瑩， 劉夢(mèng)然， 桂富榮,3,4， 萬(wàn)方浩， 喜 超,4*

1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,云南省生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 2云南省農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技管理處; 4云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院,云南 昆明 650201； 5中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東 深圳 518120

薇甘菊MikaniamicranthaH.B.K.原產(chǎn)于中、南美洲，為菊科攀緣草本植物，英文名為Mile-a-minute-weed(1分鐘1英里的雜草)，素有“植物殺手”之稱(Zhangetal.,2010)，是世界上最為嚴(yán)重的100種外來(lái)入侵物種之一(Loweetal.,2000; Mini & Abraham,2005)。薇甘菊既可以通過(guò)產(chǎn)生大量種子進(jìn)行有性繁殖、擴(kuò)散，又能夠通過(guò)極強(qiáng)的無(wú)性繁殖能力進(jìn)行傳播(周曉梅和黃炳球,2001)。自20世紀(jì)80年代初傳入我國(guó)深圳以后，已迅速擴(kuò)散至我國(guó)廣東、海南，以及云南德宏、普洱、西雙版納等地(莫南，2011; 徐小偉等，2014)，侵入當(dāng)?shù)氐墓麍@、苗圃、草坪等，對(duì)生態(tài)環(huán)境、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園林等造成了嚴(yán)重的危害，其控制管理問(wèn)題已經(jīng)成為世界性難題(徐高峰等,2014； Lietal.,2006)。薇甘菊的防除主要采用人工清除、化學(xué)防除和生物防治等方法，但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)高效防除薇甘菊方法的報(bào)道，而生物防除被認(rèn)為是有廣闊前景的一種途徑(朱西儒，2000)。

薇甘菊頸盲蝽Pachypeltissp.是一種能夠控制薇甘菊的非常重要的本地天敵。澤桑梓等(2013)研究發(fā)現(xiàn)，頸盲蝽取食薇甘菊葉片汁液后，嚴(yán)重抑制了薇甘菊葉片的光合作用，有效抑制了薇甘菊的生長(zhǎng)、繁殖，甚至造成植株枯死。國(guó)外暫未見(jiàn)頸盲蝽取食對(duì)薇甘菊影響的相關(guān)報(bào)道；國(guó)內(nèi)有研究表明，頸盲蝽取食會(huì)使薇甘菊葉片中的過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)、多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)、苯丙氨酸酶(phenylalaninase，PAL)產(chǎn)生變化(季梅等，2014)；而有關(guān)頸盲蝽取食對(duì)薇甘菊葉片營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、葉綠素含量，過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等活性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討頸盲蝽取食后薇甘菊葉片的抗氧化能力、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和葉綠素含量的變化，為薇甘菊的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

薇甘菊與頸盲蝽均采自云南省德宏州瑞麗市(98°E、24°N)。剪取長(zhǎng)度5 cm、莖直徑2 mm的薇甘菊枝條，采用口徑13.5 cm、高13.0 cm的花盆扦插種植，每盆1株。待其生長(zhǎng)40 d、株高20 cm左右時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的薇甘菊備用。采回的頸盲蝽若蟲(chóng)利用薇甘菊活株飼養(yǎng)，挑選羽化時(shí)間一致的成蟲(chóng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選12株葉片大小、高度、長(zhǎng)勢(shì)一致的薇甘菊，單株放入養(yǎng)蟲(chóng)籠內(nèi)，并在每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)籠內(nèi)接入3頭健康的新羽化的頸盲蝽成蟲(chóng)。分別于接入頸盲蝽12、24、48、96 h后，從3盆盆栽薇甘菊上采摘被取食的薇甘菊葉片，作為3次重復(fù)處理，并稱重。樣品用液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存，用于物質(zhì)含量和酶活性測(cè)定。以接入頸盲蝽前的植株作為對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)于云南省昆明市云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫箱內(nèi)進(jìn)行，每天光照12 h，光照度為15000 lx，溫度(27±1) ℃，相對(duì)濕度80%。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 酶液的提取 稱取植物葉片0.1 g，放入預(yù)冷的研缽中，用液氮研磨后加入2.5 mL預(yù)冷的提取液，冰浴下研磨成勻漿，將勻漿液12000 r·min-1、4 ℃離心10 min，上清液即為酶提取液。提取液為50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.8)，內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮。

1.3.2 各指標(biāo)的測(cè)定方法 POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，以每克鮮重每分鐘D470 nm變化0.01為一個(gè)酶活力單位(U·g-1·min-1)；SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，以每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)酶活力單位(U·mg-1)；CAT活性的測(cè)定通過(guò)鉬酸銨終止過(guò)氧化氫酶分解H2O2，并與剩余的H2O2作用生成淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm處測(cè)定其變化量，計(jì)算出酶活力，以每毫克組織蛋白每秒分解1 μmoL H2O2的量為一個(gè)酶活力單位(U·mg-1)?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定。葉綠素含量的測(cè)定：利用96%乙醇提取后，根據(jù)提取液在波長(zhǎng)665、649和470 nm下的吸光度，計(jì)算1 g新鮮葉片中葉綠素含量(張以順,2009)。以上每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用軟件Microsoft Excel 2016和SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，不同處理的薇甘菊葉片防御酶活性、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量及葉綠素含量差異，均采用單因素方差分析(One-way ANOVA: Fisher′s LSD test)。

2 結(jié)果與分析

2.1 頸盲蝽取食對(duì)薇甘菊葉片酶活性的影響

2.1.1 POD活性 如圖1A所示，頸盲蝽取食后，薇甘菊葉片中的POD活性在12～48 h內(nèi)迅速升高，在48 h時(shí)POD活性達(dá)到最大值，為對(duì)照的4.43倍，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；之后POD活性下降，但96 h時(shí)，被取食葉片的POD活性仍高于對(duì)照，與對(duì)照差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

圖1 頸盲蝽取食后薇甘菊葉片中防御酶活性和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的變化Fig.1 Changes of defensive enzyme activities and nutrient contents in M. micratha leaves after exposed to feeding by Pachypeltis sp.不同字母表示在5%水平上差異顯著。Different letters mean significant differences at 5% level.

2.1.2 SOD活性 如圖1B所示，薇甘菊被頸盲蝽取食12 h時(shí)，SOD活性較對(duì)照降低，但差異不顯著(P>0.05)；取食48 h時(shí)，被取食的薇甘菊葉片SOD活性達(dá)到最高值，與對(duì)照差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，為對(duì)照的1.47倍；取食96 h時(shí)，SOD活性較48 h降低，但仍高于對(duì)照，與對(duì)照差異不顯著(P>0.05)。

2.1.3 CAT活性 由圖1C可知，頸盲蝽取食后，薇甘菊葉片中的CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)：在取食12 h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，此時(shí)薇甘菊葉片中CAT活性較對(duì)照升高24.9%；隨后CAT活性下降，取食24 h時(shí)恢復(fù)到對(duì)照水平；取食48 h時(shí)，CAT活性較對(duì)照降低了24.4%；取食96 h時(shí)，CAT活性較48 h升高，但仍低于對(duì)照21.5%。

2.2 頸盲蝽取食對(duì)薇甘菊葉片營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和葉綠素含量的影響

2.2.1 可溶性糖含量 由圖1D可知，頸盲蝽取食后，薇甘菊葉片中可溶性糖含量持續(xù)升高，取食12、24、48、96 h時(shí)可溶性糖含量與對(duì)照相比分別高32.55%、81.71%、166.73%、169.03%，差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。其中，取食12～48 h內(nèi)，可溶性糖含量升高較快，96 h與48 h相比可溶性糖含量變化較小。

2.2.2 可溶性蛋白含量 由圖1E可知，頸盲蝽取食后，薇甘菊葉片中可溶性蛋白含量逐漸下降：取食12、24、48、96 h時(shí)可溶性蛋白含量分別比對(duì)照低13.91%、20.00%、33.67%、39.30%。其中，頸盲蝽取食48 h后，薇甘菊葉片中可溶性蛋白含量與對(duì)照差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.2.3 葉綠素含量 由圖1F可知，頸盲蝽取食后，薇甘菊葉片中葉綠素含量逐漸下降：取食12、24、48、96 h時(shí)，薇甘菊葉片中葉綠素含量均顯著低于對(duì)照(P<0.05)，分別比對(duì)照降低33.88%、51.91%、65.00%、69.94%。其中，取食12、24和48 h，葉綠素含量下降較快；取食48 h與96 h葉綠素含量相差較小。對(duì)葉片的表觀性狀觀察顯示，取食48 h時(shí)薇甘菊葉片表面已基本變?yōu)楹诤稚?/p>

3 討論

季梅等(2014)研究顯示，薇甘菊在培育60 d后，每瓶中接入20頭頸盲蝽，在96 h內(nèi)薇甘菊葉片中的POD活性總體呈下降趨勢(shì)；而本實(shí)驗(yàn)中，薇甘菊培育40 d后每株接入3頭頸盲蝽，在被取食后葉片POD活性迅速升高，取食48 h時(shí)POD活性達(dá)到最高值。有研究表明，植物發(fā)育階段以及受脅迫程度會(huì)影響POD活性(吳明江和于萍，1994)。因此，本實(shí)驗(yàn)中薇甘菊葉片POD活性的變化趨勢(shì)與季梅等(2014)研究的差異是否與頸盲蝽的接入量、薇甘菊的生長(zhǎng)時(shí)間有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。取食12 h時(shí),薇甘菊葉片中的SOD活性低于對(duì)照，之后活性逐漸上升，在48 h時(shí)與對(duì)照差異顯著；取食12 h時(shí),薇甘菊葉片中的CAT活性升高，之后逐漸降低，并在48 h時(shí)降至最低值。頸盲蝽取食96 h時(shí)，薇甘菊葉片中的POD和SOD活性較48 h降低，CAT活性較48 h升高，但仍低于對(duì)照。這說(shuō)明頸盲蝽的刺吸脅迫會(huì)引起薇甘菊葉片酶促防御反應(yīng)中關(guān)鍵酶活性的變化，并最終導(dǎo)致薇甘菊葉片關(guān)鍵酶活性降低，對(duì)頸盲蝽的抵御能力下降，葉片防御酶系統(tǒng)受到破壞。

葉綠體是植物光合作用過(guò)程中吸收光能的器官，其中，葉綠素是葉綠體中的主要色素，直接參與光合作用中光能的吸收、傳遞、分配和轉(zhuǎn)化等過(guò)程(代惠萍，2013)。頸盲蝽取食后，薇甘菊葉片中葉綠素含量顯著下降，在取食96 h時(shí)降到最低值，被取食葉片出現(xiàn)萎蔫和壞疽。這說(shuō)明頸盲蝽的取食嚴(yán)重破壞了薇甘菊的光合系統(tǒng)，抑制了薇甘菊葉片的光合作用。澤桑梓等(2013)田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在頸盲蝽取食初期，薇甘菊葉片表面會(huì)形成大小不一的斑點(diǎn)；取食面積超過(guò)葉面積50%后，隨著日照、蒸騰作用加強(qiáng)，可導(dǎo)致葉片皺縮甚至死亡。本實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，薇甘菊葉片無(wú)論在被取食初期還是后期，受害部位均會(huì)逐漸枯萎，說(shuō)明頸盲蝽取食對(duì)薇甘菊葉片造成了不可逆轉(zhuǎn)的損傷。

寄主植物中可溶性糖、蛋白質(zhì)、氨基酸是昆蟲(chóng)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些物質(zhì)的缺乏或搭配比例不當(dāng)，會(huì)影響昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，通過(guò)降低昆蟲(chóng)的生存率而獲得抗蟲(chóng)性(李傳明等，2017； 張風(fēng)娟等,2006)。李傳明等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，辣椒可以通過(guò)增加自身可溶性糖含量、降低可溶性蛋白的含量來(lái)增強(qiáng)對(duì)煙粉虱的抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，頸盲蝽取食后，薇甘菊葉片可溶性糖含量比未被取食葉片顯著上升，可溶性蛋白含量逐漸下降，在48 h與對(duì)照差異顯著。對(duì)于還原糖、可溶性糖、可溶性蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量與抗蟲(chóng)的相關(guān)性，目前尚無(wú)定論(李繼東,2003; 王秋芬等,2015； 王紫薇等,2016)。另有研究表明，刺吸式昆蟲(chóng)會(huì)根據(jù)不同的寄主植物和不同的生理需要，通過(guò)唾液組分的改變來(lái)達(dá)到取食和發(fā)育的目的，一些蝽類(lèi)的唾液酶中包含的淀粉酶、蛋白酶、海藻糖酶等能幫助其對(duì)食物進(jìn)行體外消化，將食物的淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖，并最終經(jīng)消化系統(tǒng)分解為葡萄糖(嚴(yán)盈等，2008； Azevedoetal.,2007; Kazzazietal.,2005)。因此，對(duì)于頸盲蝽取食后薇甘菊葉片中可溶性糖與可溶性蛋白含量等的變化是植物自身抗蟲(chóng)性的調(diào)節(jié)還是由某些物質(zhì)分解導(dǎo)致，需進(jìn)一步研究。

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