乳蛋白及水解物對(duì)益生菌增殖的影響

李雪霞，張娜，楊曉婉

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱，150076）

0　引 言

益生菌如嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌對(duì)健康有許多益處，越來越多地被應(yīng)用到乳制品中。然而，益生菌若要獲得所期望的效果，必須達(dá)到足夠的數(shù)量和活力[1]。市場(chǎng)上益生菌產(chǎn)品的生存能力普遍較低，容易受周圍環(huán)境的影響，從而導(dǎo)致食品中益生菌的數(shù)量不足，嚴(yán)重影響其發(fā)揮作用[2]，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)牛乳并不是益生菌生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基[3-4]，因此，許多研究試圖改善牛奶及其制品的成分，以期促進(jìn)益生菌增殖。

1　乳蛋白的主要組分及對(duì)益生菌增殖的效果

乳蛋白主要為酪蛋白和乳清蛋白兩大類，具有含量豐富，分布廣泛等特點(diǎn)。大量研究證實(shí)酪蛋白，乳清蛋白及二者的水解物均能促進(jìn)益生菌增殖。

1.1　酪蛋白及其水解物對(duì)益生菌增殖作用

酪蛋白是乳中的含磷蛋白質(zhì)，約為牛乳中總蛋白含量的80%[5]，自1953年，Gyorgy首次發(fā)現(xiàn)母乳促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)后，研究人員開始進(jìn)一步研究和闡明母乳中的雙歧桿菌促生長(zhǎng)因子[6，7]。Azum a以質(zhì)量濃度為10 g/L的κ-酪蛋白為原料，證實(shí)母乳κ-酪蛋白可作為嬰兒雙歧桿菌SI2（一株自母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離的菌株）促進(jìn)生長(zhǎng)因子，但用凝乳酶或胃蛋白酶水解后促生長(zhǎng)效果更好[8]。Prou lx發(fā)現(xiàn)，最適于促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)的商業(yè)酪蛋白水解物中含有99.6%分子量小于2 000 u的小肽[9]，并在1994年發(fā)現(xiàn)通過A lcalase，糜蛋白酶或胰蛋白酶水解酪蛋白酸鈉獲得的多肽（M P）、氨基酸和小肽級(jí)分（AA）的分子質(zhì)量分布，其中A lcalase水解的小于2 000 u的M P和AA含量最高分別為98.46%和99.02%[10]。同樣，St-Gelais發(fā)現(xiàn)添加相對(duì)分子質(zhì)量分布小于2000 u的酪蛋白水解物于培養(yǎng)基中能顯著促進(jìn)乳酸球菌W g2生長(zhǎng)[11]。

酪蛋白水解物對(duì)不同的益生菌增殖的效果也不同，在2006年Zhang以酪蛋白為原料利用堿性蛋白酶在不同水解度條件下得到水解產(chǎn)物，以嗜酸乳桿菌的菌數(shù)作為考察指標(biāo)，未水解的酪蛋白為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)水解度為10.1%的水解產(chǎn)物對(duì)嗜酸乳桿菌的促進(jìn)效果最為明顯，為對(duì)照組的1.2倍[12]。同時(shí)，趙紅宇對(duì)酪蛋白、乳清蛋白、乳清蛋白水解物和大豆水解物的促進(jìn)益生菌增殖效果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)添加1%酪蛋白水解物對(duì)雙歧桿菌Pba增殖效果最顯著，與空白相比提高超過1 mL-1（對(duì)數(shù)值），同時(shí)發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌Ac，雙歧桿菌In f'的生長(zhǎng)（P＜0.05）也可以顯著促進(jìn)，其中雙歧桿菌In f'增長(zhǎng)近1個(gè)對(duì)數(shù)周期，而對(duì)于保加利亞乳桿菌3和嗜熱鏈球菌9的生長(zhǎng)基本沒有影響，對(duì)數(shù)值僅為0.02 mL-1[13]；不同來源的水解物增殖效果不同，如與牛乳來源的酪蛋白糖巨肽（Casein glycopeptides，CGM P）相比，母乳來源的CGM P對(duì)雙歧桿菌的增殖效果是牛乳來源CGM P的4倍[8]；酶的種類也會(huì)影響到增殖效果，如湯茜分別將牛乳κ-酪蛋白的堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳酶酶解產(chǎn)物以及CGM P在體外培養(yǎng)24 h后都對(duì)雙歧桿菌BBM N 68具有增殖效果，其中，增殖作用最強(qiáng)的是堿性蛋白酶水解產(chǎn)物，活菌數(shù)達(dá)到109mL-1[14]；酪蛋白水解物對(duì)益生菌具有促進(jìn)作用的同時(shí)，也表現(xiàn)出對(duì)有害菌的不同程度的抑制效果，在連續(xù)給予小鼠喂食CGM P 15 d后，乳桿菌、腸桿菌科以及雙歧桿菌數(shù)量顯著增加（P＜0.01），大腸菌群顯著減少（P＜0.05），而腸球菌沒有顯著變化[15]。

1.2　乳清蛋白及其酶解物對(duì)益生菌增殖作用

Janer等人用實(shí)驗(yàn)證明，從牛奶或從山羊和綿羊奶中共同提取的乳清蛋白的濃縮物（w hey protein concentrate，W PC），可以促進(jìn)牛奶中乳酸雙歧桿菌的生長(zhǎng)。在牛奶中加入2%W PC培養(yǎng)24 h，活菌數(shù)可達(dá)109cfu/mL[16]。

1.2.1α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

從牛奶分離出來的α-乳白蛋白在氨基酸比例和結(jié)構(gòu)，以及功能特性上與母乳都非常相似，這使α-乳白蛋白在“母乳化”嬰兒配方食品中得到廣泛應(yīng)用[17]。Bury發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充α-lactalbumin或β-lactoglobu lin可以達(dá)到同樣添加量的W PC相同效果的63%，并發(fā)現(xiàn)促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)的組分是熱穩(wěn)定的，在加熱到121℃持續(xù)5 min并沒有失去促進(jìn)生長(zhǎng)效果，提出促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)的組分可能是a-核苷酸，非蛋白氮，或者一些細(xì)菌蛋白胨中所沒有的特定熱穩(wěn)定肽[18]。Petschow和Talbot也提出除了α-乳白蛋白之外，β-乳球蛋白也是較好的促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)的因子[19]。2007年，M iralles還證實(shí)糖基化的β-乳球蛋白對(duì)大腸桿菌具有殺菌作用[19-20]。

1.2.2乳鐵蛋白

母乳喂養(yǎng)的嬰兒與配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒相比較體內(nèi)的雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)要多，這是乳鐵蛋白與母乳其他因子共同作用的結(jié)果[21]。雙歧桿菌是乳鐵蛋白耐性細(xì)菌，據(jù)報(bào)道乳鐵蛋白促進(jìn)雙歧桿菌在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的生長(zhǎng)。Kim等在存在和不存在乳鐵蛋白的情況下培養(yǎng)24 h后測(cè)試四種雙歧桿菌菌株的生長(zhǎng)，結(jié)果顯示相對(duì)于沒有添加乳鐵蛋白的培養(yǎng)物，通過660 nm處的OD值測(cè)量發(fā)現(xiàn)全脂乳鐵蛋白對(duì)短雙歧桿菌，嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌具有適度的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，但對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌無促進(jìn)作用[22]。Yam auchi通過給予嬰兒喂食包含牛乳鐵蛋白嬰兒配方奶粉，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白促進(jìn)短雙歧桿菌JCM 1192數(shù)量增加約20%[23]。H u以新生豬為對(duì)象研究含重組人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因牛奶對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)效果，從腸道樣本的細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)喂食富含乳鐵蛋白乳粉的豬結(jié)腸中的雙歧桿菌和腸道乳酸菌的數(shù)量分別為8.74和10.11 log cfu/g，比普通乳粉分別增加0.08和0.61 log cfu/g[24]。

表1　乳清蛋白和酪蛋白及其水解物對(duì)益生菌增殖研究概況

1.2.3乳清蛋白水解物（W PH）

國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)一些益生菌在添加W PH的脫脂乳培養(yǎng)基中顯著增長(zhǎng)[25]。Cham pagne研究比較了保加利亞乳桿菌在乳清蛋白、W PH和牛乳中的生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)W PH的促生長(zhǎng)效果優(yōu)于乳清蛋白[26]。白鳳翎的研究同樣發(fā)現(xiàn)乳培養(yǎng)基中添加乳清蛋白水解物對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，其中對(duì)嗜熱鏈球菌作用高于保加利亞乳桿菌近1.5 log cfu/mL。以W PH作為添加物，同時(shí)以乳清蛋白和乳清蛋白酸水解物作為參照物進(jìn)行嗜酸乳桿菌B增殖實(shí)驗(yàn)，從600 nm處OD值可以看出，在37℃培養(yǎng)12 h后，與對(duì)照組相比，嗜酸乳桿菌B培養(yǎng)12 h的OD值平均比對(duì)照組高0.119，差異顯著，說明在培養(yǎng)基中添加W PH會(huì)對(duì)嗜酸乳桿菌具有顯著的增殖效果[27]。韋慧娟研究乳清蛋白水解物對(duì)干酪乳桿菌增殖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乳清蛋白水解物替代量為30%時(shí)干酪乳桿菌促生長(zhǎng)作用最強(qiáng)，在分別培養(yǎng)4 h和12 h活菌數(shù)分別高達(dá)7.41和8.58 log cfu/mL，同時(shí)OD值也驗(yàn)證了這一變化趨勢(shì)，分別為0.5和4.0左右[28]。

乳清蛋白和酪蛋白及其水解物對(duì)益生菌增殖研究概況整理如表1所示。

2　益生菌增殖作用研究所應(yīng)用的技術(shù)

常用分析測(cè)定益生菌的技術(shù)有實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和熒光原位雜交（FISH）技術(shù)，用于確定細(xì)菌菌數(shù)的方法還有重量法，吸光度（即比濁法）和活菌計(jì)數(shù)法。

2.1　實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-tim e po lym erase chain reaction，R eal-tim e PCR）是一種定量測(cè)定樣品中特定DN A序列的聚合酶鏈反應(yīng)。即使用標(biāo)記（最常用是熒光標(biāo)記）的PCR引物，因而能夠通過熒光監(jiān)測(cè)到每一次PCR循環(huán)后擴(kuò)增所得DN A產(chǎn)物的量，從連續(xù)監(jiān)控下獲得的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，可推導(dǎo)得樣品中被擴(kuò)增模板DN A的原初含量。R eal-tim e PCR被廣泛應(yīng)用到乳蛋白促益生菌增殖作用的研究中。M artín在研究母乳含有雙歧桿菌以及他們是否可以通過母乳喂養(yǎng)傳播給嬰兒的腸道的研究中應(yīng)用real-tim e PCR測(cè)定母乳中雙歧桿菌的數(shù)量[29]。江巖也采用了real-tim e PCR，分析不同劑量的乳源CGM P對(duì)小鼠腸道雙歧桿菌增殖水平的影響[30]。而 Mullié使用 PCR檢測(cè)法檢測(cè)了雙歧桿菌對(duì)21個(gè)健康用牛奶喂養(yǎng)的嬰兒的糞便中的雙歧桿菌進(jìn)行研究[31]。田梅將real-time PCR法與常規(guī)細(xì)菌鑒定法進(jìn)行了比較。研究通過對(duì)4662例腹瀉患者的糞便標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行real-time PCR法與常規(guī)細(xì)菌鑒定法檢測(cè)，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)兩種方法無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），對(duì)real-time PCR檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌鑒定法檢測(cè)，陽(yáng)性率為100%。研究證實(shí)real-time PCR法檢測(cè)沙門菌與志賀菌結(jié)果可靠，檢測(cè)時(shí)間短，更能滿足臨床診斷腸道疾病的需求[32]。

2.2　熒光原位雜交（FISH）技術(shù)

FISH是以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導(dǎo)分子結(jié)合，雜交后再通過免疫細(xì)胞化連接上熒光染料。FISH具有敏感、快速、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)，不但能顯示于中期分裂相中，還能顯示于同期核中。Bruck使用熒光原位雜交技術(shù)研究可能促 進(jìn)由雙歧桿菌主導(dǎo)的胃腸道微生物的生長(zhǎng)的牛乳[33]。Sm ehilová應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)比較了母乳喂養(yǎng)的過敏性結(jié)腸炎嬰兒和健康嬰兒的糞便菌群，應(yīng)用FISH對(duì)雙歧桿菌、大腸桿菌和酪酸梭菌活菌進(jìn)行定量檢測(cè)得出健康嬰兒腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量最多，通過雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)的健康嬰兒雙歧桿菌細(xì)菌計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)值為（9.87±0.76）g-1，F(xiàn)ISH程序檢測(cè)到的雙歧桿菌為9.94±0.46 log cfu/g。在過敏性結(jié)腸炎雙歧桿菌嬰兒檢測(cè)雙歧桿菌計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)值為（8.12±0.88）g-1，F(xiàn)ISH檢測(cè)的對(duì)數(shù)值為（8.27±0.32）g-1，兩種方法檢測(cè)結(jié)果無顯著的差異[34]。FISH也被用于探討CGM P對(duì)小鼠糞便微生物群的影響，F(xiàn)ISH被證明是一個(gè)快速和相對(duì)低成本的檢測(cè)方法，可用于進(jìn)一步的理解人類腸道微生物[35]。

2.3　其他方法

除上述用來研究益生菌增殖的方法，還有一些用來測(cè)定益生菌菌數(shù)的方法，如重量法，吸光度（比濁法）和活菌計(jì)數(shù)法。其中，重量法作為經(jīng)典的分析方法準(zhǔn)確度高，但是重量分析法操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿足控制分析的需要，且在微生物操作中無菌操作困難，容易感染雜菌。該法一般不用于分析菌液濃度的變化。佟曉芳在一種益生菌發(fā)酵米乳的制備方法中就應(yīng)用到了重量法[36]。吸光度（即比濁法）測(cè)菌液濃度來比較細(xì)菌生長(zhǎng)情況在益生菌增菌中應(yīng)用較多，該法操作簡(jiǎn)單，精確度高。張英春采用比濁法測(cè)定潛在益生菌生長(zhǎng)曲線，從而研究益生菌促進(jìn)人體健康和防止疾病中發(fā)揮作用[35]。張強(qiáng)在測(cè)定三株益生菌發(fā)酵特性中也應(yīng)用了比濁法[37]。此外，最常用的活菌計(jì)數(shù)法即平板計(jì)數(shù)法，還有厭氧滾管計(jì)數(shù)法等[38]。培養(yǎng)基培養(yǎng)技術(shù)對(duì)此課題的研究是十分重要的，微生物培養(yǎng)基的酸堿度、凝膠強(qiáng)度和選擇性等直接影響到培養(yǎng)基的質(zhì)量。

3　結(jié)束語(yǔ)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的對(duì)健康的強(qiáng)烈追求和渴望，益生菌及其制品成為研究的熱點(diǎn)，被廣泛地用于醫(yī)學(xué)、食品、生物等領(lǐng)域，在食品領(lǐng)域，益生菌產(chǎn)品尤其是益生菌乳制品的開發(fā)越來越得到人們的重視，成為益生菌研究的主流方向。但乳蛋白對(duì)益生菌增殖作用的機(jī)制仍不明了，進(jìn)一步研究和闡述乳蛋白對(duì)益生菌增殖作用的機(jī)制將進(jìn)一步解決人們腸道健康問題。乳蛋白對(duì)益生菌增殖作用的研究報(bào)道還不夠全面，基于益生菌對(duì)于人類健康的益處，進(jìn)行相關(guān)研究更具有深遠(yuǎn)的意義，也將成為未來的發(fā)展趨勢(shì)。

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