miR-135在前列腺癌中的診斷價(jià)值研究

趙宇明，張 悅，王 華，郭冬梅，田 寶，張立民，鄭 龍

(1.秦皇島市第一醫(yī)院 泌尿外科，河北 秦皇島066000;2.秦皇島市婦幼保健院 婦科，河北 秦皇島066000;3.河北醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)研究室，河北 石家莊050017)

前列腺癌(PCa)是臨床常見(jiàn)的男性惡性腫瘤，發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，并且向低齡方向發(fā)展[1]。臨床常采用直腸指診和血清前列腺特異性抗原(PSA)篩查前列腺癌，但直腸指診的敏感性低、PSA檢測(cè)特異性較差，存在一定程度的誤診或漏診。目前發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞釋放腫瘤內(nèi)源性的miRNA(microRNA)進(jìn)入外周循環(huán)，結(jié)合于體內(nèi)靶基因mRNA3'，誘導(dǎo)miRNA靶基因降解，外周血游離miRNA能夠用于腫瘤診斷與預(yù)后[2]。本文采用PCR檢測(cè)血清miR-135的表達(dá)水平，分析其與 PCa病理參數(shù)的的相關(guān)性，以便指導(dǎo)臨床診斷，改善患者預(yù)后。

1 材料和方法

1.1臨床資料

選取2016年1月至12月我院PCa患者75例、良性增生(BPH)患者52例及40例健康人群，經(jīng)病理活檢確診。病理分級(jí)依據(jù)2003年WHO分類標(biāo)準(zhǔn)Gleason評(píng)分[3]，根據(jù)腺體分化程度，積分為2、3、4分者相當(dāng)于高分化腺癌，腺體形態(tài)完好；5、6、7分者相當(dāng)于中分化腺癌，腺體伴有少量的發(fā)育不全或融合成篩狀；8、9、10分者相當(dāng)于低/未分化癌，發(fā)育不全，融合成篩狀腺體，或缺乏腺體結(jié)構(gòu)，伴壞死。Glerson積分>7分，癌腫分化程度差，伴有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、壞死，染色變化明顯。腫瘤分期按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。其中PCa組術(shù)前未行治療，平均年齡(58.33±6.47)歲；BPH患者平均年齡(56.27±5.49)歲，健康患者平均年齡(57.31±5.50)歲，排除伴發(fā)糖尿病、心血管疾病、其它惡性腫瘤、精神疾病、腎病等，本研究獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書，3組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1RNA提取 收集患者血清300 μl，所有的血清標(biāo)本保存在-80 ℃。用上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的mirVanaTMPARISTMmiRNA試劑盒，提取并測(cè)定RNA濃度[4]。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 以總RNA5 μl為模板，應(yīng)用上海慧穎生物科技有限公司生產(chǎn)的TaqManMicroRNA Reverse Transcription試劑盒反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物為miR-135特異性的莖環(huán)引物(ABI)，反應(yīng)條件控制：85℃5 min，42℃30 min，16℃30 min。熒光定量 PCR總反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件控制：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min。在ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成，均重復(fù)3次反應(yīng)[5]，計(jì)算相對(duì)定量表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1血清miR-135表達(dá)水平

PCa組miR-135表達(dá)水平(18.36±3.85)較BPH組(6.11±2.02)和對(duì)照組 (5.50±1.52)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 血清miR-135的相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2miR-135表達(dá)與PCa的相關(guān)性

Glerson積分>7組的 miR-135的表達(dá)量要高于Glerson積分<7組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。臨床分期越高，血清miR-135表達(dá)越高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

miRNA是存在于人體內(nèi)長(zhǎng)度為22nt的微小單鏈，屬于內(nèi)源性表達(dá)的小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用[6]。它能夠通過(guò)結(jié)合于體內(nèi)靶基因mRNA3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR),二者發(fā)生作用，抑制miRNA靶基因翻譯，誘導(dǎo)其降解,楊曉冬[7]等認(rèn)為miRNA靶基因在機(jī)體中發(fā)揮促癌或抑癌功能。

表2 血清miR-135表達(dá)水平與 PCa相關(guān)性比較%]

miR-135是長(zhǎng)度為22nt的非編碼微小單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，在體內(nèi)結(jié)合于靶基因miRNA3'端非翻譯區(qū)，家族成員包括miR-135a，在機(jī)體中抑制Wnt信號(hào)通路中APC基因的表達(dá)，有促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖的作用，發(fā)揮類似癌基因樣的作用[8]。付強(qiáng)[9]等研究證實(shí)miR-135a調(diào)控JAK2通路，其表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡；miR-135a參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡，在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miR-135a發(fā)揮重要的調(diào)控作用，促使癌細(xì)胞由激素依賴轉(zhuǎn)化為激素非依賴，miR-135a在激素非依賴前列腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，在細(xì)胞中外源性高表達(dá)后，顯著抑制細(xì)胞增殖能力，提示miR-135a具有抑癌基因作用，可以抑制STAT6與DNA結(jié)合，抑制STAT6蛋白的表達(dá)。

miRNA具有促癌功能，在PCa的腫瘤細(xì)胞變異增殖過(guò)程中，促癌基因被激活，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖增加、凋亡減少，從而導(dǎo)致惡性病變并進(jìn)一步進(jìn)展[10]。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，miRNA在前列腺癌、BPH及健康者血清中，表達(dá)水平由高到低(χ2=5.821,P<0.01)，差距巨大[11]，表明miRNA檢測(cè)可作為敏感性較強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物，指導(dǎo)臨床診斷、評(píng)估預(yù)后。血清中存在腫瘤特異性miRNA，在PCa患者中，miR-135表達(dá)與臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，林楠[12]發(fā)現(xiàn)miR-21與miR-155的表達(dá)水平在淋巴瘤患者中明顯增高，表達(dá)越高預(yù)后越差，并且存活率也較低，miRNA基因來(lái)源于腫瘤，它的表達(dá)量能夠反映腫瘤的性質(zhì)、大小、臨床分期，為臨床診斷提供參考。李天壽[13]等提出血漿microRNA表達(dá)譜可作為PCa非編碼的小分子的標(biāo)志物，通過(guò)miR-30c、miR-1285、let-7c和miR-622 等表達(dá)，能夠準(zhǔn)確區(qū)分腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)，診斷出PCa的腫瘤分級(jí)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期。

本文對(duì)三組研究對(duì)象進(jìn)行miR-135水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)健康組(5.50±1.52)、良性增生組(6.11±2.02)及PCa組(18.36±3.85)的miR-135表達(dá)依次升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miR-135表達(dá)在臨床中能夠能較好地判定前列腺腫瘤性質(zhì)，區(qū)分惡性腫瘤、良性增生或健康人群；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在PCa患者中Gleason積分大于7者其血清miR-135水平明顯增加；臨床分期越高，分化程度越差，miR-135的表達(dá)水平越高，表明 miR-135是高風(fēng)險(xiǎn)腫瘤的標(biāo)志物，可作為PCa診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志[14]。

綜上所述，在人類激素非依賴前列腺癌中，miR-135表現(xiàn)為具有促進(jìn)腫瘤增殖的功能，可作為PCa診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物，可以通過(guò)表達(dá)制定治療策略，非侵入性操作，診斷準(zhǔn)確率高，有助于降低死亡率，提高患者的生存質(zhì)量。

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