胰腺導(dǎo)管腺癌中miR-21、Bcl-2、c-Myc及PTEN表達(dá)水平及臨床意義

趙立新,辛瑞強(qiáng),李勝利,胡志偉,劉連杰,阿斯根,薩其日拉圖

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 肝膽外科,內(nèi)蒙古 呼和浩特010017)

過(guò)去幾十年,胰腺癌的發(fā)病率逐年上升,胰腺癌具有高度侵襲性,預(yù)后較差,發(fā)病率與死亡率基本相當(dāng),在世界范圍內(nèi)也是最具挑戰(zhàn)的惡性腫瘤[1,2]。性別、年齡、吸煙、肥胖、糖尿病可能與胰腺癌發(fā)病有關(guān),但確切病因仍不清楚。近來(lái)MiR-21在基因調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中受到廣泛的關(guān)注,在直腸癌、胃癌、乳腺癌及肺癌報(bào)道較多[3-6]。本研究擬選取胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象,探討miR-21、Bcl-2、C-myc及PTEN在胰腺導(dǎo)管腺癌癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況,闡明miR-21在胰腺導(dǎo)管腺癌中的可能發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1臨床資料收集我院2012年12月-2015年12月胰腺導(dǎo)管腺癌的組織學(xué)標(biāo)本共38例,以及正常胰腺組織12例,組織標(biāo)本離體后立即放在液氮中保存。所選手術(shù)病例術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療及生物治療,所有病例均簽署知情同意書(shū)。38例標(biāo)本男性25例,女性13例；年齡在42-79歲,中位年齡62.5歲；腫瘤位于胰頭部的25例,腺尾部13例。胰腺癌病理分期參照2010年的胰腺癌UICC/AJCCNM分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑Bcl-2抗體、c-Myc抗體、PTEN抗體(p-actin Abeam公司),Taq MicroRNA Reverse Transcription (ABI公司),Trizol Reagent(Invitrogen公司),EDTA(美國(guó)Promega公司),羊抗鼠二抗(美國(guó)Jackson公司),ABC試劑盒和DAB試劑盒(美國(guó)Vector公司),DYY6B電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司),超低溫冰箱(日本三洋公司),熒光定量PCR儀及分析軟件(美國(guó)ABI),FluorChem 9000凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha Innotech公司),ambda 35紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(Perkin Elamr公司)。

1.3Real-timePCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平收集患者胰腺導(dǎo)管腺癌組織標(biāo)本及癌旁配對(duì)的正常胰腺組織樣本,提取mRNA,分光光度計(jì)分析總RNA純度和濃度,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA的完整性。按照Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的操作程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。按照Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的miR-21通用引物及內(nèi)參U6和PTEN、Bcl-2和c-Myc的引物及內(nèi)參β-actin,使用ABI7300Real-timePCR系統(tǒng)對(duì)上述檢測(cè)指標(biāo)(miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc)進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。設(shè)定程序?yàn)椋?1)52℃反應(yīng)1 min；2) 92℃反應(yīng)5 min；3) 92℃反應(yīng)10 sec；4) 56℃反應(yīng)50 sec；5)重復(fù)步驟第3)到第5)一共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果計(jì)算：2-ΔCt表示real-time PCR相關(guān)目的基因在組織的表達(dá)水平。

1.4Western-blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)提取收集的胰腺癌組織及正常胰腺組織總蛋白,按試劑盒操作要求,經(jīng)PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉及PTEN、Bcl-2以及c-Myc 抗體雜交,然后用化學(xué)發(fā)光顯色鑒定,再用凝膠成像系統(tǒng)成像。計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量(目的條帶的灰度值/同一樣本內(nèi)參的灰度值)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用配對(duì)T檢驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌組織與癌旁組織的目的基因平均表達(dá)水平,χ2檢驗(yàn)檢測(cè)各基因相對(duì)表達(dá)水平與胰腺臨床病理特征之間的相互關(guān)系,P<0.05表示差 異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)采用SPSS15.0軟件包。

2 結(jié)果

2.1miR-21在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)分別提取胰腺導(dǎo)管腺癌組織、正常組織總RNA,利用QRT-PCR法檢測(cè)miR-21的表達(dá)情況,在胰腺導(dǎo)管腺癌組織樣本中miR-21的平均相對(duì)表達(dá)量為3.37±0.25,正常胰腺組織中其平均相對(duì)表達(dá)量為0.74±0.07,胰腺導(dǎo)管腺癌組織樣本中miR-21的平均表達(dá)水平要明顯高于正常胰腺組織樣本的平均表達(dá)水平(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2PTEN蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)與正常組織中表達(dá)量比較,Western blot分析顯示PTEN蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織表達(dá)顯著下降,差異顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.87±0.032,0.54±0.024，P<0.05)。 見(jiàn)圖1。

2.3Bcl-2蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)與正常對(duì)照組相比,Bcl-2蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織的表達(dá)顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.12±0.014,0.39±0.031,P< 0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4c-Myc蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)與正常胰腺組相比,c-Myc蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織的表達(dá)顯著增加,差異顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.054±0.003,0.21±0.020,P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖1胰腺導(dǎo)管腺癌組織中PTEN蛋白的表達(dá)差異圖2胰腺導(dǎo)管腺癌組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)差異圖3胰腺導(dǎo)管腺癌組織中c-Myc蛋白的表達(dá)差異

2.5miR-21、Bcl-2、c-Myc及PTEN表達(dá)水平與胰腺導(dǎo)管腺癌臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1。

表1 miR-21、Bcl-2、c-Myc及PTEN表達(dá)水平與胰腺導(dǎo)管腺癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

MicroRNAs是一類大約20個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA[7,8],參與細(xì)胞的分化、增殖、細(xì)胞周期和代謝等各種生物過(guò)程。更重要的是它能通過(guò)激活原癌基因和抑制抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9,10]。miR-21是最常見(jiàn)的與癌癥相關(guān)的MicroRNA,先前的研究顯示miR-21在許多癌癥中表達(dá)失調(diào),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[11-13]。miR-21的潛在機(jī)制通過(guò)作用于PTEN增強(qiáng)腫瘤的侵襲力。本研究通過(guò)Real-time PCR法檢測(cè)胰腺導(dǎo)管腺癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-21的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-21在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)要顯著高于對(duì)應(yīng)的正常胰腺組織,表明miR-21與胰腺導(dǎo)管腺癌密切相關(guān),參與了胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生發(fā)展。

PTEN是一種抑癌基因。在細(xì)胞遷移、擴(kuò)散和侵襲中起著重要作用。能通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)AKT信號(hào)通路[14,15],使AKT信號(hào)通路失活,進(jìn)一步干擾下游眾多的信號(hào)通路,從而調(diào)控腫瘤的增殖、遷移和侵襲[16,17]。Meng等[18]發(fā)現(xiàn)抑制肝癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)能提高PTEN的表達(dá)。Giovannetti 等[19]報(bào)道轉(zhuǎn)染pre-miR-21能引起PTEN表達(dá)的下降。提示PTEN是miR-21的直接靶基因。本研究通過(guò)Western-blot方法檢測(cè)胰腺導(dǎo)管腺癌組織及胰腺癌旁組織中PTEN蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)PTEN在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)下調(diào),表明PTEN參與了胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生發(fā)展。

Bcl-2基因?yàn)橐职┗?能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。c-Myc基因是一種重要的原癌基因,它促進(jìn)細(xì)胞分裂,本研究結(jié)果顯示Bcl-2、c-Myc在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)要明顯高于正常胰腺組織,提示Bcl-2、c-Myc與胰腺導(dǎo)管腺癌密切相關(guān),可能通過(guò)抑制胰腺導(dǎo)管細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其增殖、分化參與胰腺癌的發(fā)病過(guò)程。

本研究發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管腺癌組織中miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc的表達(dá)與T分期、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移和TNM分期有密切關(guān)系。盡管上述四個(gè)指標(biāo)中miR-21、Bcl-2和c-Myc的表達(dá)明顯升高,PTEN表達(dá)明顯降低。但是在T分期Ⅲ+Ⅳ、存在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期Ⅲ+Ⅳ胰腺導(dǎo)管腺癌患者的癌組織中,miR-21、Bcl-2和c-Myc的表達(dá)升高、PTEN表達(dá)降低更加明顯。miR-21和PTEN的表達(dá)在腫瘤的大小方面也有這種趨勢(shì)。而miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc的表達(dá)在患者的年齡、性別以及腫瘤的部位方面則無(wú)這種差別。提示miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc可能或共同參與胰腺導(dǎo)管腺癌的分化及轉(zhuǎn)移,與腫瘤的進(jìn)展程度有關(guān),可以用于胰腺導(dǎo)管腺癌的診斷及預(yù)后。

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