慢性阻塞性肺疾病急性加重期外周血淋巴細(xì)胞免疫分型變化研究的臨床價值

楊東升，劉培培，侯松萍

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 呼吸科，吉林 長春130033)

世界銀行和世界衛(wèi)生組織的資料表明，2020年，COPD將位居世界疾病經(jīng)濟負(fù)擔(dān)的第5位，其居高不下的發(fā)病率和死亡率，為人類生存及經(jīng)濟負(fù)擔(dān)提出了巨大挑戰(zhàn)[1]。目前某些研究結(jié)果初步顯示細(xì)胞免疫參與了COPD的病因、發(fā)病機制、恢復(fù)及預(yù)后整個過程[2,3]。如果能通過測定COPD患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化，準(zhǔn)確評估COPD急性加重期患者的氣道炎癥以感染為主，還是免疫損傷為主，或者兩者并存，此外，還能對患者免疫力高低做出準(zhǔn)確評估，對于指導(dǎo)臨床應(yīng)用激素或增強免疫力的藥物時機的選擇有重要意義。現(xiàn)本文通過檢測COPD患者外周血淋巴細(xì)胞的免疫分型變化，了解T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等在COPD急性加重期患者的變化，對COPD病人免疫功能進行評估，準(zhǔn)確判斷患者是否存在細(xì)胞免疫功能紊亂或機體免疫力低下，或者兩者并存，為COPD患者何時用激素、何時用增強免疫力的藥物提供一定的實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料

選取吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院2014年12月至2015年9月慢性阻塞性肺疾病患者90例，納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會2013年修訂版慢性阻塞性肺疾病診治指南[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：不能配合完成支氣管舒張實驗者，合并其它心肝腎等疾病者，近期使用激素、免疫抑制劑等影響免疫功能的患者，伴有其他部位慢性炎癥的患者。確診90例COPD患者，年齡35-77歲，平均65.01±9.76歲，其中男35例，女55例， 根據(jù)COPD患者肺功能FEV1占預(yù)計值百分比的數(shù)值結(jié)果，把患者分為Ⅰ(25例)、Ⅱ(18例)、Ⅲ(22例)、 Ⅳ(25例)四組；根據(jù)患者血氣分析結(jié)果分為呼吸衰竭組(41例)和無呼吸衰竭組(49例)；根據(jù)mMRC呼吸困難癥狀評級結(jié)果分為輕度(22例)、中度(21例)、重度(21例)、極重度(26例)四組[4]；根據(jù)患者病程長短分為≤10年(32例)、10-20年(28例)、≥20年(30例)三組；分別測定上述觀察指標(biāo)的不同組別患者外周血淋巴細(xì)胞免疫分型CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD56+、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值。另選取25例健康人作為正常對照組，年齡36-75歲，平均65.89±11.67 歲，其中男10例，女性15例。

1.2方法

1.2.1儀器和試劑 CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3- PC5(貨號6607013)；細(xì)胞裂解液：OptiLyse○RNO-lysing Solution(貨號：A11894)；流式細(xì)胞儀：Beckman Coulter FC500；以上所有試劑均購自美國Beckmen Coulter公司。肺功能測定采用MasterScreenPneumo型肺功能儀 (德國康爾福盛CareFusion公司)，技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)參考2005年美國胸科學(xué)會和歐洲呼吸協(xié)會共同制定的肺功能測試標(biāo)準(zhǔn)[5]；血氣分析測定采用GEMpremier3500分析檢測儀(美國Instrumentation Laboratory公司)。

1.2.2血液樣本制備 采集患者及正常健康人外周血2 ml，加入到EDTA抗凝的真空管中混勻。取兩只流式細(xì)胞儀上樣管，分別命名為同型對照管和實驗管，每管中均加入100 μl抗凝全血，然后分別加入20 μl同型對照抗體和CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5抗體和CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-PC5，充分混勻，避光室溫孵育15 min；然后向每管中加入紅細(xì)胞裂解液500 μl，充分混勻，避光孵育10 min后加入500 μl PBS，1 000 r/min離心5 min，棄上清，每管加入500 μl鞘液，混勻，等待上機檢測。血氣分析動脈血由專業(yè)人員采集，采用一次性威世德動脈血氣針，型號3302通用性動脈血氣針，由全自動血液細(xì)胞分析儀讀取結(jié)果。

1.2.3指標(biāo)測定 外周血淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞檢測均采用流式細(xì)胞檢測技術(shù)，由我院中心實驗室專人操作檢測。每管獲取細(xì)胞1×104個，以熒光抗體染色陽性細(xì)胞所占百分比記錄結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1COPD 組與正常對照組的性別、年齡、身高無顯著性差異，見表1。

表1 COPD急性加重期患者與正常人的一般資料比較

2.2COPD急性加重期患者不同肺功能分級外周血淋巴細(xì)胞免疫分型結(jié)果

肺功能III級組與正常對照組相比CD3+CD4+淋巴細(xì)胞明顯增高(P<0.05)，具體見表2。

表2 COPD患者不同肺功能分級的外周血淋巴細(xì)胞免疫分型結(jié)果

與正常對照組相比較*P<0.05

2.3COPD急性加重期患者不同血氧程度的外周血淋巴細(xì)胞免疫分型結(jié)果

CD3+及CD3+CD4+淋巴細(xì)胞無呼吸衰竭組較呼吸衰竭組及正常對照組明顯增高(均P<0.01)。CD3-CD56+NK細(xì)胞呼吸衰竭組較無呼吸衰竭組明顯增高。CD3+CD4+/CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比值無呼吸衰竭組與呼吸衰竭組及正常對照組相比均明顯增高(P<0.05)，具體見表3。

表3 COPD患者不同血氧程度的外周血淋巴細(xì)胞免疫分型結(jié)果

與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01；無呼衰組與呼衰組比較★P<0.05，★★P<0.01

2.4COPD患者呼吸困難不同嚴(yán)重程度的外周血淋巴細(xì)胞免疫分型結(jié)果

CD3+淋巴細(xì)胞mMRC 0-1級組與正常對照組及mMRC3-4級組比較，均明顯增高，前者P<0.05，后者P<0.01；mMRC 2-3級組較mMRC3-4級組明顯增高(P<0.05)。CD3+CD4+淋巴細(xì)胞mMRC2-3級組較正常對照組及mMRC3-4級組明顯增高(均P<0.01)，CD3+CD56+NK細(xì)胞mMRC3-4級組與mMRC 0-1級組比較明顯增高(P<0.05)，見表4。

表4 COPD患者呼吸困難不同程度的外周血淋巴細(xì)胞免疫分型結(jié)果

與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01；mMRC 0-1級組與mMRC3-4級組比較,◢P<0.05，◢◢P<0.01；mMRC 2-3級組與mMRC3-4級組比較★P<0.05，★★P<0.01

2.5COPD急性加重期患者不同病程外周血淋巴細(xì)胞免疫分型結(jié)果

CD3+淋巴細(xì)胞病程≤10年組較正常對照組明顯升高(P<0.05),見表5。

表5 COPD急性加重期患者不同病程外周血淋巴細(xì)胞免疫分型結(jié)果

與正常對照組比較*P<0.05

3 討論

慢性阻塞性肺疾病是發(fā)病率居高不下的慢性炎癥性疾病，越來越多的研究表明T、B、NK細(xì)胞等在調(diào)節(jié)COPD的慢性炎癥反應(yīng)中起到了重要作用，因此，研究免疫性致病因素在COPD疾病進展中的作用具有重要意義。本文表3顯示：COPD急性加重期無呼吸衰竭的患者，外周血CD3+、CD3+CD4+淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值明顯高于呼吸衰竭組及正常對照組；表4顯示CD3+淋巴細(xì)胞mMRC 0-1級組與正常對照組及mMRC3-4級組比較，均明顯增高；mMRC 2-3級組較mMRC3-4級組明顯增高(P<0.05)；表4還顯示CD3+CD4+淋巴細(xì)胞mMRC2-3級組較正常對照組及mMRC3-4級組明顯增高(均P<0.01)。結(jié)合表2顯示COPD肺功能III級患者也以CD3+CD4+淋巴細(xì)胞增高為主；表5顯示CD3+淋巴細(xì)胞病程≤10年組較正常對照組明顯升高(P<0.05)。這些結(jié)果提示COPD早、中期患者，外周血CD3+、CD3+CD4+淋巴細(xì)胞反應(yīng)明顯強于正常人和呼吸衰竭病人。另外，表3還顯示CD3-CD56+NK細(xì)胞呼吸衰竭組較無呼吸衰竭組明顯增高，并且，表4也顯示CD3+CD56+NK細(xì)胞mMRC3-4級組與mMRC 0-1級組比較也明顯增高?？傊?，上述結(jié)果表明COPD患者早期至中期階段，無呼吸衰竭之前，以CD3+、CD3+CD4+淋巴細(xì)胞參與COPD的炎癥反應(yīng)為主；有呼吸衰竭時以CD3-CD56+NK細(xì)胞參與COPD的炎癥反應(yīng)為主。

表3顯示無呼吸衰竭的COPD患者其CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值明顯增高，這可能是由于COPD患者出現(xiàn)呼吸衰竭前，機體的免疫系統(tǒng)受COPD急性加重因素的刺激，患者體內(nèi)多種類型的淋巴細(xì)胞被顯著激活、積極參與機體的免疫反應(yīng)所致；表3還顯示呼吸衰竭的COPD患者其CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值與正常對照組相比，無明顯增高，考慮其原因是隨著病情加重，COPD患者出現(xiàn)呼吸衰竭，機體缺氧、二氧化碳潴留嚴(yán)重，免疫功能受到一定程度的損傷，機體的免疫系統(tǒng)受COPD急性加重因素的刺激后，CD3+CD4+/CD3+CD8+雖然增高，但是，免疫系統(tǒng)對外來刺激免疫應(yīng)答反應(yīng)強度有限所致。

CD56分子是自然殺傷細(xì)胞 (NK細(xì)胞)表面主要的表面標(biāo)志，NK細(xì)胞不僅是機體內(nèi)的第一道免疫防御屏障，而且也具有免疫調(diào)節(jié)功能，對T、B淋巴細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞具有調(diào)控作用(免疫自穩(wěn))；在機體抗感染過程中也發(fā)揮重要作用。本文研究結(jié)果顯示呼吸困難評分mMRC3-4級組以CD3+CD56+增高為主，CD3-CD56+NK細(xì)胞呼吸衰竭組較無呼吸衰竭組明顯增高，說明NK細(xì)胞參與了COPD極重度患者的疾病進展過程，可能隨著患者病情加重，NK細(xì)胞逐漸被激活，進一步發(fā)揮其免疫調(diào)控作用和抗感染作用。有研究結(jié)果表明COPD患者外周血NK、NK-T細(xì)胞數(shù)量下降，并且其細(xì)胞毒性功能也降低[6]。Ying Tang等研究表明NK細(xì)胞在COPD急性發(fā)作期數(shù)量顯著增高，但是其分泌IFN-γ的功能下降[7]。因此，NK細(xì)胞在COPD患者急性加重期的數(shù)量和功能變化還有待進一步研究。

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[4]慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)，中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2013,36(4)：255.

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