肝細(xì)胞核因子1α基因rs7310409多態(tài)性與健康成人血清AFP水平顯著相關(guān)

史瑞崎，邵冬華，何美琳，梁國(guó)威

(北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)科，北京100049)

在遺傳持續(xù)性甲胎蛋白(HPAFP) 家族中的研究顯示，AFP基因上游200 bp啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的2個(gè)肝細(xì)胞核因子-1α(HNF1α)結(jié)合位點(diǎn)的堿基變異(-119G>A和-55C>A)是HPAFP者血清AFP非疾病性顯著升高的原因[1,2]。這2個(gè)位點(diǎn)變異可導(dǎo)致HNF1α結(jié)合AFP啟動(dòng)子序列同源性的增加，增強(qiáng)HNF1α結(jié)合AFP基因啟動(dòng)子的能力，導(dǎo)致AFP基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，進(jìn)而引起血清AFP水平顯著持續(xù)升高。上述研究提示HNF1α在調(diào)控AFP基因表達(dá)中起著關(guān)鍵作用，也提示基因變異與血清AFP水平具有顯著相關(guān)性。rs7310409(A/G)，位于HNF1α基因第1內(nèi)含子內(nèi)，是與人體多種復(fù)雜性狀或疾病相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性位點(diǎn)。全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(GWAS)顯示，rs7310409多態(tài)性與C-反應(yīng)蛋白(CRP)[3]、谷氨酰氨基轉(zhuǎn)移酶[4]和胰腺癌[5]皆具有顯著相關(guān)性。我們推測(cè)rs7310409與血清AFP水平也具有顯著相關(guān)性，并在616例漢族成年健康人中驗(yàn)證rs7310409與血清AFP水平的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象收集我院2017年1月至2017年8月健康體檢人員資料。根據(jù)調(diào)查問卷和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)，將患有急、慢性乙型、丙型病毒性肝炎(HBsAg抗原和HCV抗體陽性)、飲酒(男性≥140 g/周，女性≥70 g/周)、懷孕、肝癌和其它各種腫瘤的調(diào)查對(duì)象剔除。共計(jì)獲得完整資料的調(diào)查對(duì)象616例(男性：407例，年齡范圍：25-65 歲；女性：209例，年齡范圍：25-65歲)。

1.2方法(1)臨床基本資料調(diào)查：測(cè)量所有受試者身高、體重，并計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)；血壓取3次測(cè)量平均值；(2)實(shí)驗(yàn)室檢查：使用真空采血管(美國(guó)BD公司提供)抽取空腹靜脈血，血液離體2h內(nèi)檢測(cè)完畢。采用全自動(dòng)生化分析儀(日本OLYMPUS公司AU 2700)測(cè)定甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、高密度和低密度脂蛋白膽固醇(HDL-C和LDL-C)、空腹血糖(FPG)、CRP、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，由日本OLYMPUS公司提供配套試劑。血清AFP測(cè)定采用美國(guó)雅培公司 i2000 免疫分析儀(USA) 進(jìn)行檢測(cè)，批內(nèi)、批間變異系數(shù)(CV值)分別為3.5%-4.7%和4.1%-8.1%，由雅培公司提供配套試劑。

1.3非酒精性脂肪肝(NAFLD)診斷采用美國(guó)Philips公司(IU-22型)B型超聲影像儀，行腹部B型超聲進(jìn)行診斷[6]。

1.4外周血基因組DNA提取EDTA抗凝外周全血200 μl用于基因組DNA提取，采用天根生化科技(北京)有限公司的血液、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒，按試劑盒說明操作。提取后的基因組DNA -80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5rs7310409分型檢測(cè)采用等位基因特異性引物(ARMS原理)結(jié)合TaqMan-MGB探針的熒光定量PCR方法(ARMS-TaqMan方法)進(jìn)行檢測(cè)[7]，根據(jù)ΔCt 值(ΔCt=A等位基因反應(yīng)體系Ct值減去G等位基因反應(yīng)體系Ct值)進(jìn)行分型。引物和探針采用ABI 公司的TaqExpress 軟件(Foster City,CA)進(jìn)行設(shè)計(jì)(見表1)，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司和美國(guó)ABI公司合成。(1)ARMS-TaqMan法：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度64bp，反應(yīng)體系20 μl，其中基因組DNA 2 μl，2×Master mix 8 μl和Ehance inhibit 1 μl[天根生化科技(北京)有限公司提供]，上、下游引物各1 μl(終濃度0.25 μM)，TaqMan探針1 μl(0.25 μM)，水6 μl。反應(yīng)條件為95℃ 2 min，95℃15 s、60℃ 1 min、(40個(gè)循環(huán))。循環(huán)閾值(Ct值)設(shè)定在0.03，基線設(shè)定為自動(dòng)設(shè)定基線，測(cè)定儀器為ABI 7500 熒光定量PCR儀(ABI公司，美國(guó))。(2)測(cè)序：PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度674 bp，按常規(guī)PCR條件擴(kuò)增，北京諾賽基因組研究中心有限公司完成測(cè)序。

表1 rs7310409多態(tài)性ARMS-TaqMan分型測(cè)序法的引物和探針序列

注：A和G等位基因引物3′端-2位引入錯(cuò)配堿基A (原堿基為C)，以增加基因分型特異性。

2 結(jié)果

2.1rs7310409等位基因ARMS-TaqMan法分型檢測(cè)結(jié)果

對(duì)616例研究對(duì)象采用ARMS-TaqMan方法進(jìn)行基因分型檢測(cè)，檢出成功率100%，其中AA型的ΔCt=-13.06±1.25(107例)，AG型的ΔCt=0.30±0.48(298例)，GG型的ΔCt=13.6±1.21(211例)，等位基因分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.010,P=0.919)。A和G等位基因反應(yīng)體系Ct值的變化情況見圖1。

ARMS-TaqMan方法分型后隨機(jī)選取AA型、AG型和GG型各3例，經(jīng)直接測(cè)序證實(shí)100%符合。

2.2616例研究對(duì)象的基本資料

616例研究對(duì)象基本資料見表2，男、女組間的BMI、SBP、DBP、FBG、TC、TG、HDL-C、CRP和ALT存在顯著差異(P<0.05)；年齡、LDL-C、AFP和NAFLD無顯著性差異(P>0.05)；rs7310409等位基因型分布男、女間無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 ARMS-TaqMan方法檢測(cè)616例研究對(duì)象的A和G等位基因反應(yīng)體系的Ct值散點(diǎn)圖

表2 616例研究對(duì)象的基本資料

注：P值：男、女組間比較；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓

2.3rs7310409等位基因型的血清AFP水平變化情況

血清AFP水平在AA型(107例)最低，為3.33 ± 1.57 ng/ml，AG型(298例)為3.59 ± 1.47 ng/ml，在GG型(211例)最高，為4.05 ± 1.91 ng/ml，3組間皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.038～P<0.001)。與GG型比較，攜帶AA型健康人群的血清AFP水平的平均值下降17.8%，AG型下降11.4%。見圖2。

2.4rs7310409等位基因型的血清AFP水平相關(guān)性分析

以AFP作為因變量，不同模型的線性回歸(linear regression models)分析顯示，無協(xié)變量，控制年齡和性別，以及控制年齡、性別、CRP、LDL-C、ALT、AST和 NAFLD后，皆顯示rs7310409等位基因型與血清AFP水平顯著相關(guān)(P<0.001)，見表3。

圖2rs7310409等位基因型的血清AFP水平95%可信區(qū)間(95%CI)比較圖。P值為AFP轉(zhuǎn)化為自然對(duì)數(shù)后進(jìn)行組間比較值。

表3 rs7310409等位基因型的血清AFP水平相關(guān)性分析

注：模型1：無矯正因子；模型2：控制年齡和性別；模型3：控制年齡、性別、CRP、LDL-C、ALT、AST和 NAFLD

3 討論

本研究在中國(guó)漢族健康人群中，首次證實(shí)血清AFP水平與HNF1α基因rs7310409多態(tài)性具有顯著相關(guān)性，其相關(guān)性不受性別、年齡、炎癥指標(biāo)CRP、血脂LDL-C、肝功指標(biāo)ALT和AST以及脂肪肝的影響。與rs7310409 GG型比較，攜帶AA型的表觀健康人群表現(xiàn)為血清AFP水平的平均值降低17.8%，而AG型降低了11.4%。

HNF1α屬于肝細(xì)胞核因子家族，位于染色體12q24.31，在肝臟較多表達(dá)，是調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)基因特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。HNF1α可調(diào)控超過100多種基因表達(dá)，其中大部分潛在的調(diào)控結(jié)合位點(diǎn)都位于被調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，并與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用共同調(diào)控基因表達(dá)[8]。人AFP基因啟動(dòng)子位于5′端轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-200 bp內(nèi)，能與AFP啟動(dòng)子結(jié)合的反式作用因子包括肝細(xì)胞核因子、核因子、CAAT結(jié)合/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/CEP)和成熟肝細(xì)胞AFP啟動(dòng)子結(jié)合蛋白(NP)等[9]。其中，HNF1α和HNF1β基因翻譯的蛋白通過識(shí)別AFP啟動(dòng)子Ⅰa和Ⅱ′區(qū)的5′-GTTAATNATTAAC-3′序列，并與其它蛋白形成同源或異源二聚體作用于該DNA序列增強(qiáng)AFP基因轉(zhuǎn)錄活性[8]。點(diǎn)突變方法證明HNF1α結(jié)合區(qū)之一Ⅱ′區(qū)突變時(shí)，導(dǎo)致約65%的AFP基因抑制，如Ⅰa區(qū)突變則導(dǎo)致約50%的AFP表達(dá)抑制，表明HNF1α基因及其結(jié)合區(qū)序列堿基變異對(duì)AFP基因表達(dá)起著重要作用[9]。

rs7310409多態(tài)性與血清AFP水平變化的確切機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。rs7310409 位于HNF1α基因內(nèi)含子1區(qū)，屬于非編碼核酸變異，根據(jù)國(guó)際人類基因組單體型計(jì)劃Hap Map3中國(guó)漢族人群數(shù)據(jù)，rs7310409多態(tài)性與HNF1α基因的2個(gè)非同義編碼的多態(tài)性位點(diǎn)rs1169288 (r2=0.741) 和rs2464196 (r2=0.633)存在顯著連鎖不平衡，這2個(gè)SNP位點(diǎn)變異可導(dǎo)致氨基酸改變，進(jìn)而可能影響HNF1α翻譯的蛋白活性，從而影響AFP基因表達(dá)，其確切機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。另外，rs7310409多態(tài)性與血清AFP水平相關(guān)也可能是rs7310409多態(tài)性與其它影響AFP基因表達(dá)的多態(tài)性、突變位點(diǎn)存在顯著連鎖不平衡所致。同時(shí)，近年來研究提示在許多疾病相關(guān)基因中位于內(nèi)含子上的突變可影響pre-mRNA的剪接過程，最常見的剪接突變是通過產(chǎn)生或增強(qiáng)剪接位點(diǎn)或產(chǎn)生新的分支點(diǎn)而導(dǎo)致異常剪接[10,11]。因此，rs7310409位點(diǎn)變異可能影響HNF1α基因的mRNA的剪接過程，進(jìn)而影響HNF1α翻譯的蛋白質(zhì)的活性，從而影響AFP基因表達(dá)，其確切機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

根據(jù)Hap Map3數(shù)據(jù)，不同種族人群中rs7310409多態(tài)性的最小等位基因頻率(MAF)分布具有顯著差異。本研究中A等位基因的MAF=0.329，與歐洲人群的MAF=0.420和非洲人群的MAF=0.333頻率基本相似，但與日本人群的MAF=0.535具有顯著差異。因此，rs7310409多態(tài)性與血清AFP的相關(guān)性有待于在不同種族人群中進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究在中國(guó)漢族健康人群中發(fā)現(xiàn)HNF1α基因rs7310409多態(tài)性與血清AFP具有獨(dú)立的顯著相關(guān)性，攜帶AA型、AG型等位基因的健康人群皆表現(xiàn)為血清AFP水平顯著降低。由于AFP不只是一個(gè)腫瘤特別是肝細(xì)胞癌的標(biāo)志物，還與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后，甚至基因治療靶點(diǎn)有關(guān)[12,13]，因此，AFP表達(dá)變化的分子機(jī)制研究顯得尤為重要，本研究為血清AFP水平變化提供了新的遺傳決定因子。

[1]McVey JH,Michaelides K,Hansen LP,et al.A G-->A substitution in an HNF I binding site in the human alpha-fetoprotein gene is associated with hereditary persistence of alpha-fetoprotein (HPAFP) [J].Hum Mol Genet,1993,2(4):379.

[2]Nagata-Tsubouchi Y,Ido A,Uto H,et al.Molecular mechanisms of hereditary persistence of alpha-fetoprotein (AFP) in two Japanese families A hepatocyte nuclear factor-1 site mutation leads to induction of the AFP gene expression in adult livers[J].Hepatol Res,2005,31(2):79.

[3]Reiner AP,Barber MJ,Guan Y,et al.Polymorphisms of the HNF1A gene encoding hepatocyte nuclear factor-1 alpha are associated with C-reactive protein[J].Am J Hum Genet,2008,82(5):1193.

[4]Yuan X,Waterworth D,Perry JR,et al.Population-based genome-wide association studies reveal six loci influencing plasma levels of liver enzymes[J].Am J Hum Genet,2008,83(4):520.

[5]Pierce BL,Ahsan H.Genome-wide "pleiotropy scan" identifies HNF1A region as a novel pancreatic cancer susceptibility locus[J].Cancer Res,2011,71(13):4352.

[6]Osawa H,Morry Y.Sonographic diagnosis of fatty liver using a histogram technique that compares liver and renal cortical echo amplitudes[J].J Clic Ultrasound,1996,24 (1):25.

[7]梁國(guó)威,邵冬華,劉 潔,等.PNPLA3基因rs738049檢測(cè)方法的建立及其與非酒精性脂肪肝的相關(guān)性研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2016,39(1):45.

[8]Tronche F,Ringeisen F,Blumenfeld M,et al.Analysis of the distribution of binding sites for a tissue-specific transcription factor in the vertebrate genome[J].J Mol Biol,1997,266(2):231.

[9]劉志毅,劉耕陶.甲胎蛋白的基因表達(dá)與調(diào)控[J].生理科學(xué)進(jìn)展,1994,25(2):161.

[10]Dhir A,Buratti E,van Santen MA,et al.The intronic splicing code:multiple factors involved in ATM pseudoexon definition[J].EMBO J,2010,29(4):749.

[11]Sanz DJ,Hollywood JA,Scallan MF,et al.Harrison.Cas9/gRNA targeted excision of cystic fibrosis-causing deep-intronic splicing mutations restores normal splicing of CFTR mRNA[J].PLoS One,2017,12(9):e0184009.

[12]李孟森,李 剛.甲胎蛋白在肝癌細(xì)胞免疫逃避中的作用機(jī)制[J].腫瘤研究與臨床，2006，18(7)：492.

[13]Yang X,Zhang Y,Zhang L,et al.Silencing alpha-fetoprotein expression induces growth arrest and apoptosis in human hepatocellular cancer cell[J].Cancer Lett,2008,271(2):281.