• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    DNA提取方法及在古DNA中的應(yīng)用

    2018-03-24 09:46:12張楊陳虹君龍歡楊開勇
    文物鑒定與鑒賞 2018年3期
    關(guān)鍵詞:提取方法遺骸考古

    張楊 陳虹君 龍歡 楊開勇

    摘 要:考古遺址留存下來的人類、動(dòng)物遺骨遺骸和植物殘留是古代生物信息的載體,為我們提供了重要的基因信息。文章概述了幾種古DNA提取常用的方法及原理,并介紹了這些方法在古DNA研究中的一些應(yīng)用實(shí)例。

    關(guān)鍵詞:考古;遺骸;古DNA;提取方法

    我國(guó)墓葬、考古遺址中經(jīng)常發(fā)掘出土大量豬、馬、牛、羊等動(dòng)物遺骨遺骸、古尸以及植物殘留[1-6],這些遺存為我們提供了古代動(dòng)物、植物和人類重要的基因信息。古DNA是古代生物的信息載體,作為分子生物學(xué)研究的一個(gè)工具,在建立DNA動(dòng)力學(xué)模型、探索環(huán)境改變與生物多樣性的關(guān)系、詳述滅絕動(dòng)物的飲食、驗(yàn)證過去群落結(jié)構(gòu)和基因流動(dòng)障礙、表現(xiàn)生物兩性的特性、推斷古代和現(xiàn)代人類傳播模式、澄清系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、闡明進(jìn)化發(fā)育生物學(xué)等方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[7-11]。古DNA對(duì)考古學(xué)、古生物學(xué)以及人類學(xué)科具有深遠(yuǎn)的影響,對(duì)于研究物種的起源與進(jìn)化具有重要意義。文章闡述了幾種提取古DNA的主要方法及原理,并列舉了一些應(yīng)用實(shí)例。

    1 DNA提取的主要方法

    1.1 Chelex-100法

    原理:當(dāng)檢材比較少時(shí)或者基因分型僅需要少量的DNA時(shí),可用Chelex-100提取方法來提取DNA。Chelex-100由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成,是一種螯合樹脂,含有亞氨基二乙酸鹽離子,可以整合多價(jià)金屬離子,且比一般的離子交換劑具有更強(qiáng)的金屬離子選擇性和較高的結(jié)合力,可螯合鎂離子、鈣離子等核酸必需的金屬陽離子,防止DNA降解。在低離子強(qiáng)度、堿性及煮沸的條件下,可使細(xì)胞膜破裂,并使蛋白質(zhì)變性,且結(jié)合其他有可能會(huì)影響進(jìn)一步分析的外源物質(zhì)。經(jīng)過離心,除去了Chelex-100顆粒,同時(shí)使得與DNA結(jié)合在Chelex-100上的物質(zhì)分離,保證了下一步的PCR反應(yīng),DNA分析也不受抑制劑的干擾[12]。

    方法:以血液DNA提取為例。取微量血液用約400μl純水震蕩破碎紅細(xì)胞;13,000r/min離心去上清,收集沉淀;向沉淀中加入200μl5% Chelex-100溶液(使用前要充分振搖),在振蕩器上反復(fù)振蕩,放入56°C保溫30min以上;取出后振蕩混勻,100℃保溫8min,振蕩后,13,000r/min離心3min,上清用于PCR擴(kuò)增,或放4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

    應(yīng)用:Chelex-100法適用于血跡、混合斑、毛根、尸骨等生物檢材。整個(gè)提取過程只需在一個(gè)離心管里進(jìn)行,大大減少實(shí)驗(yàn)中污染的可能性,且操作簡(jiǎn)便,耗時(shí)短,成本低廉。由于使用這種方法提取出來的DNA純度不太高,且不適合長(zhǎng)期保存,所以在實(shí)驗(yàn)室科研中該方法應(yīng)用較少。

    1.2 酚仿抽提法

    原理:苯酚使蛋白質(zhì)變性,且抑制DNase的降解,但是苯酚會(huì)微溶于水。氯仿不溶于水,且苯酚易溶于氯仿,所以可以有效去除苯酚,而且還可以萃取出其他脂類雜質(zhì)。異戊醇可以減少蛋白質(zhì)變性過程中產(chǎn)生氣泡,而且還有助于不同溶質(zhì)相的分離,使離心后上層含有DNA的水相、中間變形蛋白相及下層有機(jī)溶劑相保持穩(wěn)定。所以一般酚仿抽提法首先用苯酚抽提,再用25∶24∶1的苯酚-氯仿-異戊醇抽提,最后為了徹底去除苯酚(苯酚對(duì)PCR擴(kuò)增有強(qiáng)烈的抑制作用),采用24:1的氯仿-異戊醇抽提一次,然后用異丙醇或乙醇沉淀DNA。

    方法:先用細(xì)胞裂解液和蛋白酶K消化樣品,取上清,加入等體積Tris-飽和酚,緩慢顛倒混勻10min后4℃低溫12000rpm/min離心10min,再取上清,加入等體積的25∶24∶1的苯酚-氯仿-異戊醇,緩慢顛倒混勻10min后4℃低溫12000rpm/min離心10min,再取上清,加入等體積的24:1的氯仿-異戊醇,緩慢顛倒混勻10min后4℃低溫12000rpm/min離心10min,加入0.6~1倍體積異丙醇緩慢搖至沉淀出白色的DNA,4℃低溫12000rpm/min離心5min,棄上清留下DNA沉淀,加入75%乙醇洗滌DNA沉淀,再次離心去上清洗滌DNA,最后離心取上清,留下DNA沉淀,空氣中放置揮發(fā)干凈乙醇,加入60~100?L水溶解DNA。

    應(yīng)用:苯酚氯仿法可以用來提取各種生物的各種組織細(xì)胞的DNA,是提取DNA最常用的方法,方法步驟雖然不一,但這種技術(shù)對(duì)于高質(zhì)量DNA提取是十分有效的。但是在提取古DNA過程中,一些色素物質(zhì)在沉淀DNA時(shí)會(huì)一起沉淀,這些物質(zhì)一般都是PCR反應(yīng)中DNA聚合酶的抑制劑,會(huì)影響之后的PCR擴(kuò)增效率。而且實(shí)驗(yàn)過程中需反復(fù)萃取,每一步都有DNA的損失,要求實(shí)驗(yàn)樣品有較高的DNA含量。另外,苯酚、氯仿是有機(jī)溶劑,對(duì)人體和環(huán)境影響較大。因此,現(xiàn)在古代生物樣品的DNA提取通常不采用苯酚氯仿法。

    1.3 堿裂解法

    原理:堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)染色體DNA與質(zhì)粒DNA在變性和復(fù)性上的差異來達(dá)到分離它們的目的。在pH為12.6的強(qiáng)堿溶液里,染色體DNA的堿基之間的氫鍵會(huì)斷裂,使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的堿基之間的大多數(shù)氫鍵也會(huì)斷裂,但是超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈?zhǔn)遣粫?huì)完全分離的[13],當(dāng)以pH為4.8的NaAc緩沖溶液去調(diào)節(jié)其pH到中性時(shí),變性了的質(zhì)粒DNA又會(huì)恢復(fù)變性之前的構(gòu)型而保存在溶液中,而染色體DNA則不能復(fù)性,形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),經(jīng)過離心,染色體DNA及其他大分子物質(zhì)一起被去除。

    方法:收集菌液,加入溶菌液,搖動(dòng)混勻,冰浴10min。加入SDS-NaOH溶液冰浴10min。加入pH4.8的NaAC溶液冰浴10min。4℃10000r/min離心10min,小心地把上層清液倒入到另一個(gè)新離心管中,加入預(yù)冷好的無水乙醇,再把離心管放置-20℃冰箱中1h,沉淀析出DNA,離心10min,丟棄上清液,加入無菌水或TE緩沖液溶解DNA。

    應(yīng)用:堿裂解法主要用于菌液、動(dòng)物毛發(fā)等樣品的DNA快速提取,其優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)單、快速,價(jià)格低廉,不需大型儀器設(shè)備。但是不足之處是十分明顯的:一是pH值調(diào)節(jié)不準(zhǔn)確會(huì)導(dǎo)致隨后的PCR擴(kuò)增經(jīng)常失敗,二是提取的DNA中包含大量的蛋白質(zhì),純度不高,不適合做Southern或其他對(duì)DNA質(zhì)量要求高的實(shí)驗(yàn)。

    1.4 二氧化硅(硅粒)法

    原理:當(dāng)溶液中的pH值低于或等于二氧化硅表面pKa值時(shí),二氧化硅表面攜帶的負(fù)電荷就會(huì)減少,與DNA分子帶的負(fù)電荷之間的排斥力也隨之減小,會(huì)形成很多的水合離子,降低了DNA分子的水合程度,DNA分子從而集聚到二氧化硅的表面上。另外,細(xì)胞裂解劑干擾了雙鏈DNA分子之間氫鍵的形成,從而產(chǎn)生了單鏈DNA分子,DNA單鏈分子與二氧化硅表面形成氫鍵,這種氫鍵力遠(yuǎn)高于DNA分子與二氧化硅表面的靜電排斥力。先用洗滌液洗掉吸附有DNA分子的二氧化硅表面的其他雜質(zhì),再用pH值高于pKa的溶液洗脫吸附在二氧化硅表面上的DNA分子[13]。

    方法:采用Rohland N[14]的方法步驟。

    應(yīng)用:二氧化硅法是基于常用于提取古DNA的硅粒法的基礎(chǔ)之上而改進(jìn)的,傳統(tǒng)的硅粒法在提取DNA時(shí)僅僅使用了高濃度的異硫氰酸胍來裂解骨粉,這對(duì)骨粉只進(jìn)行了有限的裂解,DNA并沒有完全的釋放出來[15]。本文采取的方法里的提取溶液含有EDTA和蛋白酶K,EDTA的作用是脫鈣,蛋白酶K的作用是消化組織和包圍了DNA的蛋白質(zhì),兩者結(jié)合使用,可以使骨粉得到更好的裂解,充分釋放出DNA。此方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),可有效去除PCR抑制物,且提取的DNA純度高,適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)、大規(guī)模使用,可提取年限久遠(yuǎn)的骨骼DNA。

    1.5 試劑盒法

    原理:試劑盒法中含有吸附材料,可以特異性地吸附DNA,過濾RNA及蛋白質(zhì)等雜質(zhì),市場(chǎng)上主要有硅離心試劑盒,磁珠法試劑盒等。

    方法:每種試劑盒的操作步驟見各種試劑盒的說明書。

    應(yīng)用:試劑盒法操作簡(jiǎn)單、規(guī)范,是提取和純化DNA的比較簡(jiǎn)便的方法,硅離心柱試劑盒在市場(chǎng)上比較普遍,成本低,在提取古DNA研究中比較常用。磁珠法試劑盒提取純化DNA有著更好的效果,在提取古DNA實(shí)驗(yàn)中有著明顯的優(yōu)勢(shì),但是成本較高[16]。

    2 DNA提取方法在古DNA研究中的應(yīng)用案例

    Faerman[17]等在提取古骨頭DNA鑒定性別時(shí),使用了蛋白酶K消化,酚-仿抽提和Chelex純化相結(jié)合的方法,發(fā)現(xiàn)使用Chelex純化的DNA比不使用Chelex純化的DNA得到了更好的PCR結(jié)果,并且在該實(shí)驗(yàn)中,Chelex的純化效果比其他方法好,可以適用于很少樣本量(少于1mg)的樣本。Tracqui和Ludes[18]在提取古人類骨頭DNA實(shí)驗(yàn)中使用了酚-仿抽提法提取DNA,再用CleanMix purification kit純化DNA,所得的DNA在后續(xù)的PCR擴(kuò)增等步驟中進(jìn)行順利。Maria de Lourdes Mu?oz[19]等人利用3種方法提取前西班牙人(距今200~1500年)的骨頭及組織的DNA,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序,發(fā)現(xiàn)第1種方法最好。第1種方法:使用提取溶液(0.01M Tris-HCl,0.1 M EDTA and 0.2% SDS pH 8.0)和蛋白酶K消化及溫育后,再用酚-仿抽提法提取,接下來用Amicon? Ultra-0.5 30 kDa columns濃縮。第2種:使用提取溶液(0.01 M Tris-HCl, 0.5 M EDTA pH 8.0),溫育后再使用結(jié)合溶液(5M GuSCN, 0.025 M NaCl, 0.010 M Tris-HCl pH 8.0),然后QIAquick (Qiagen) silica column過濾,最后用TE緩沖液洗脫。第3種:苯酚-氯仿異戊醇(24∶4∶1)提取的DNA與5% Chelex-100在94℃煮10分鐘,再離心。郭麗萍[20]等在研究明代古尸時(shí)使用了經(jīng)典的酚-仿抽提法和Chelex-100法提取肌肉DNA,并用QiAquick PCR Purification Kit (Qiagen)純化,得到了較好的結(jié)果。

    Calvignac[21]等對(duì)古熊類樣本進(jìn)行DNA提取時(shí),先用蛋白酶K和提取溶液進(jìn)行抽提,然后用苯酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)洗三次上清液,再用Centricon 30 column濃縮DNA并用超純水洗脫,最后用QIAquick kit (QIAGEN)純化。H?ss和P??bo[22]在提取25000年前的馬屬動(dòng)物的DNA時(shí)使用了硅粒法,并將它鑒定為野驢。Rohland和Hofreiter[23]用更新世時(shí)期洞熊的骨頭和牙齒樣本試驗(yàn)了Silica,Centricon,Phenol/chloroform,DNeasy tissue kit,DNeasy tissue kit,DNA IQ system這6種方法,發(fā)現(xiàn)silica方法效果最好,同時(shí)對(duì)silica方法進(jìn)行了優(yōu)化。Dabney[24]等在研究更新世中期洞熊時(shí)用Rohland和Hofreiter的方法提取了35bp~150bp一系列的DNA片段,發(fā)現(xiàn)隨著DNA片段從150bp減少到35bp,提取效率也從75%降到25%。對(duì)此,他們改進(jìn)了該方法,使之在提取35bp的DNA片段時(shí)達(dá)到提取150bp的效率。Cole[25]等報(bào)道了新西蘭古DNA的研究進(jìn)展,包括幾維鳥、查塔姆島鴨和哈斯特鷹等生物,以及骨頭、毛發(fā)、博物館樣品中提取出的古DNA,成功揭露了新西蘭不同生物的進(jìn)化史和系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    Wood等[26]對(duì)新西蘭北部圖比多灣海岸線共濟(jì)會(huì)酒館考古遺址發(fā)現(xiàn)的距今750年左右的狗糞便化石分析時(shí),一方面用EDTA、SDS和蛋白酶K溶液消化樣品,取上清液,再用Dneasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)提取DNA并進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)分析,另一方面用氫氧化鉀和鹽酸對(duì)化石樣品預(yù)處理,再用顯微鏡對(duì)上浮液分析,結(jié)果表明了糞化石來自于歐洲人還未遷移到新西蘭之前的狗,并揭示了這些狗的飲食習(xí)慣。

    蔡大偉等[27]使用了基于硅粒法和硅離心柱法的4種方法(方法A :Modified Silica Particles Method;方法B:Ceneclean Method ;方法 C :QIA amp Method;方法 D:Modified QIA quick method)提取5個(gè)距今約4000年的線粒體DNA,之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)基于硅離心柱方法的PCR成功率明顯優(yōu)于基于硅粒法的方法,Modified QIA quick method的效果最好。Levison等[28]用磁珠法從1.5mL的大腸桿菌JM109細(xì)胞培養(yǎng)中提取到了8.2?g的高質(zhì)量的DNA,從每100?L的大馬哈魚精子水溶里提取到了至少14?L的DNA。樊龍江[29]對(duì)該方法稍作改進(jìn)后,提取古稻樣品的DNA,并用植物界保守通用引物和水稻分子標(biāo)記SSR引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠檢測(cè),獲得了清晰的目標(biāo)條帶。

    參考文獻(xiàn)

    [1]宋艷波,劉延常,徐倩倩.臨沭東盤遺址龍山文化時(shí)期動(dòng)物遺存鑒定報(bào)告[J].海岱考古,2017(00):139-149.

    [2]趙文丫,王子孟,王杰.東營(yíng)廣北農(nóng)場(chǎng)一分場(chǎng)一隊(duì)東南遺址動(dòng)物遺存分析報(bào)告[J].海岱考古,2017(00):242-247.

    [3]關(guān)毅.中美研究人員合作考古發(fā)現(xiàn)新的古老型人類[J].自然雜志,2017(02):95、102.

    [4]戴玲玲,陶洋,闞緒杭.淮河中游地區(qū)的史前生業(yè)經(jīng)濟(jì)考察——安徽省侯家寨遺址出土動(dòng)物骨骼研究[J].東南文化,2017(01):62-70.

    [5]吳文婉,張繼華,靳桂云.河南登封南洼遺址二里頭到漢代聚落農(nóng)業(yè)的植物考古證據(jù)[J].中原文物,2014(01):109-117.

    [6]武忠弼,田鴻生,曾云鶚.江陵鳳凰山168號(hào)墓西漢古尸研究(綜合報(bào)告)[J].武漢醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1980(01)1-10、87-95.

    [7]蔡祿,羅遼復(fù).DNA動(dòng)力學(xué)柔性的統(tǒng)計(jì)力學(xué)模型[J].生物物理學(xué)報(bào),2001(02):311-317.

    [8]侯衛(wèi)國(guó),董海良,蔣宏忱,等.沉積物中古DNA在古生態(tài)、古環(huán)境和古氣候研究中的應(yīng)用[J].地學(xué)前緣,2017,(02):286-291.

    [9]楊周岐,張虎勤,張金,等.古人類骨骼DNA降解影響因素分析[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006(01):90-92.

    [10]李法軍,金海燕,朱泓,等.姜家梁新石器時(shí)代遺址古人類的食譜[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2006(06):1001-1007.

    [11]寧超.中國(guó)北方古代人群基因組學(xué)研究[D].吉林大學(xué),2017.

    [12]周毅.牛白血病病毒gp51基因的克隆、表達(dá)及ELISA抗體檢測(cè)方法的建立[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

    [13]何少蓉.復(fù)合磁性粒子的制備及分析應(yīng)用[D].重慶大學(xué),2005.

    [14]Rohland N,Hofreiter M. Ancient DNA extraction from bones and teeth[J]. Nature protocols, 2007, 2(7):1756-1762.

    [15][27]蔡大偉,王海晶,韓璐,等.4種古DNA抽提方法效果比較[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007(01):13-16.

    [16]柳天雄,羅佳,黃菊芳,等.古DNA提取技術(shù)新進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,(26):5170-5175.

    [17]Faerman M, Filon D, Kahila G, et al. Sex identification of archaeological human remains based on amplification of the X and Y amelogenin alleles[J]. Gene, 1995, 167(1): 327-332.

    [18] Keyser-Tracqui C, Ludes B. Methods for the study of ancient DNA[J]. Forensic DNA typing protocols, 2005: 253-264.

    [19]de Lourdes Mu?oz M, Lopez-Armenta M, Moreno-Galeana M, et al. Extraction and Electrophoresis of DNA from the Remains of Mexican Ancient Populations[M]//Gel Electrophoresis-Advanced Techniques. InTech, 2012.

    [20]郭麗萍,劉建興,李楨,等.復(fù)合擴(kuò)增云南明朝古尸DNA分析[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2009,(03):9-11.

    [21] Calvignac S, Hughes S, Tougard C, et al. Ancient DNA evidence for the loss of a highly divergent brown bear clade during historical times[J]. Molecular Ecology, 2008, 17(8): 1962-1970.

    [22]H?ss M, P??bo S. DNA extraction from Pleistocene bones by a silica-based purification method[J]. Nucleic acids research, 1993, 21(16): 3913-3914.

    [23]Rohland N, Hofreiter M. Ancient DNA extraction from bones and teeth[J]. Nature protocols, 2007, 2(7): 1756-1762.

    [24]Dabney J, Knapp M, Glocke I, et al. Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA fragments[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2013, 110(39): 15758-15763.

    [25]Cole T L, Wood J R. The ancient DNA revolution: the latest era in unearthing New Zealands faunal history[J]. New Zealand Journal of Zoology, 2017: 1-30.

    [26]Wood J R, Crown A, Cole T L, et al. Microscopic and ancient DNA profiling of Polynesian dog (kurī) coprolites from northern New Zealand[J]. Journal of Archaeological Science: Reports, 2016, 6: 496-505.

    [28]Levison P R, Badger S E, Dennis J, et al. Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification[J]. Journal of Chromatography A, 1998, 816(1): 107-111.

    [29]樊龍江,桂毅杰,鄭云飛,等.河姆渡古稻DNA提取及其序列分析[J].科學(xué)通報(bào),2011,(Z2):2398-2403.

    猜你喜歡
    提取方法遺骸考古
    十大考古發(fā)現(xiàn)
    英語世界(2022年9期)2022-10-18 01:10:52
    考古出乎意料的幾件事
    英語世界(2022年9期)2022-10-18 01:10:46
    三星堆考古解謎
    適合金銀花不同組織總RNA提取方法的篩選
    果膠的提取及應(yīng)用研究進(jìn)展
    果膠的提取及應(yīng)用研究進(jìn)展
    不同提取方法對(duì)骨碎補(bǔ)中總黃酮含量的影響比較
    36具志愿軍遺骸在韓入殮 31日歸國(guó)
    韓將歸還68具志愿軍遺骸
    考古與論今
    阿來研究(2014年1期)2014-02-27 06:18:37
    亚洲男人天堂网一区| 91成年电影在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲av电影在线进入| 一级片免费观看大全| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成人18禁在线播放| 亚洲av五月六月丁香网| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久精品欧美日韩精品| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品国产高清国产av| 日韩欧美 国产精品| av欧美777| 听说在线观看完整版免费高清| 国产成+人综合+亚洲专区| 日本五十路高清| 99精品欧美一区二区三区四区| 性色av乱码一区二区三区2| 丰满的人妻完整版| 国产精品久久久人人做人人爽| 草草在线视频免费看| 91字幕亚洲| 免费在线观看影片大全网站| 999精品在线视频| 成人av一区二区三区在线看| 大型黄色视频在线免费观看| www.自偷自拍.com| 亚洲自拍偷在线| 男女午夜视频在线观看| 香蕉av资源在线| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲精品美女久久av网站| 丁香欧美五月| 一边摸一边做爽爽视频免费| 99国产精品99久久久久| 久久草成人影院| av视频在线观看入口| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲美女黄片视频| 国产视频一区二区在线看| av免费在线观看网站| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品国产高清国产av| 色老头精品视频在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产亚洲精品一区二区www| 91在线观看av| 老司机在亚洲福利影院| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲 国产 在线| 国产爱豆传媒在线观看 | 高清毛片免费观看视频网站| av福利片在线| 亚洲免费av在线视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 成人高潮视频无遮挡免费网站| av天堂在线播放| 日韩三级视频一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 午夜a级毛片| 大型av网站在线播放| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久人人精品亚洲av| 99在线人妻在线中文字幕| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产成人av激情在线播放| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲最大成人中文| 国产高清激情床上av| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美黄色淫秽网站| 成人国产综合亚洲| 精品人妻1区二区| 午夜福利欧美成人| 九色成人免费人妻av| 日本免费a在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 9191精品国产免费久久| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲人与动物交配视频| 国产熟女xx| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产一区二区在线av高清观看| 精品欧美国产一区二区三| 国内精品久久久久精免费| 久久精品国产综合久久久| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲精品国产一区二区精华液| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 免费观看人在逋| 国产97色在线日韩免费| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 青草久久国产| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久久久国内视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 无限看片的www在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久久性生活片| 在线国产一区二区在线| 国产成人系列免费观看| 亚洲五月天丁香| 亚洲国产精品久久男人天堂| 妹子高潮喷水视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 婷婷亚洲欧美| 99精品欧美一区二区三区四区| 真人一进一出gif抽搐免费| 啦啦啦免费观看视频1| 国产av一区在线观看免费| 中文字幕最新亚洲高清| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产成人aa在线观看| 午夜激情福利司机影院| 国产av麻豆久久久久久久| 成人欧美大片| 女同久久另类99精品国产91| 男女午夜视频在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 免费看十八禁软件| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美大码av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 中文字幕熟女人妻在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 禁无遮挡网站| 首页视频小说图片口味搜索| 成人一区二区视频在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 日韩欧美国产一区二区入口| 搡老岳熟女国产| 日韩精品青青久久久久久| 午夜a级毛片| 久久香蕉国产精品| 嫩草影院精品99| 好男人在线观看高清免费视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品一区二区精品视频观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 丁香欧美五月| 中文字幕熟女人妻在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 三级毛片av免费| 成人国语在线视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 麻豆国产av国片精品| svipshipincom国产片| 中文资源天堂在线| 桃色一区二区三区在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 男人舔奶头视频| 丰满人妻一区二区三区视频av | 成人国语在线视频| 午夜久久久久精精品| 无人区码免费观看不卡| 人妻久久中文字幕网| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲成人久久性| 国产男靠女视频免费网站| 久久精品国产清高在天天线| 91av网站免费观看| 久久久久性生活片| 国产野战对白在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久久久久久久久黄片| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产成人aa在线观看| 性欧美人与动物交配| 欧美一级毛片孕妇| 黑人欧美特级aaaaaa片| 窝窝影院91人妻| 亚洲乱码一区二区免费版| www日本在线高清视频| 手机成人av网站| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产成人av教育| 91麻豆av在线| 欧美中文综合在线视频| 九色国产91popny在线| 免费无遮挡裸体视频| www日本在线高清视频| 欧美成人午夜精品| 在线视频色国产色| 久久天堂一区二区三区四区| 51午夜福利影视在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 日韩精品青青久久久久久| 日韩国内少妇激情av| 欧美中文综合在线视频| 1024视频免费在线观看| 午夜老司机福利片| 欧美黄色淫秽网站| xxx96com| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产亚洲欧美98| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| www国产在线视频色| 日本在线视频免费播放| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 窝窝影院91人妻| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲美女黄片视频| 天堂动漫精品| 夜夜爽天天搞| 热99re8久久精品国产| 99热这里只有是精品50| 老司机在亚洲福利影院| 精品久久久久久,| 亚洲人成77777在线视频| 欧美色视频一区免费| www.熟女人妻精品国产| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲国产精品999在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲天堂国产精品一区在线| 一级黄色大片毛片| 国产精品一区二区三区四区久久| 精品久久久久久成人av| 最好的美女福利视频网| 国产av又大| 特级一级黄色大片| 色综合站精品国产| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久国产欧美日韩av| 久久久国产成人免费| 色老头精品视频在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩欧美 国产精品| 99国产精品一区二区蜜桃av| 人人妻人人看人人澡| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久草成人影院| 999精品在线视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品久久久久久成人av| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日韩精品青青久久久久久| 99热只有精品国产| 一边摸一边抽搐一进一小说| 天堂影院成人在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日韩欧美三级三区| 久久久久国内视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 婷婷亚洲欧美| av欧美777| 1024视频免费在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 90打野战视频偷拍视频| 一级毛片女人18水好多| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 老汉色av国产亚洲站长工具| svipshipincom国产片| 国产av在哪里看| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品亚洲美女久久久| 国产成人av教育| 在线观看66精品国产| av在线天堂中文字幕| 久久久精品大字幕| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲av成人av| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产野战对白在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 桃红色精品国产亚洲av| 成年免费大片在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲人成伊人成综合网2020| 特大巨黑吊av在线直播| bbb黄色大片| 看片在线看免费视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久精品国产亚洲av高清一级| 99热这里只有精品一区 | 精品日产1卡2卡| 露出奶头的视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 午夜精品在线福利| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品影院久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 成人18禁在线播放| av在线播放免费不卡| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产成人av激情在线播放| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 最近视频中文字幕2019在线8| 这个男人来自地球电影免费观看| 日本在线视频免费播放| 叶爱在线成人免费视频播放| 老司机福利观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产午夜精品久久久久久| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 国产av又大| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 精品久久久久久久毛片微露脸| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产高清视频在线播放一区| 淫秽高清视频在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 中文字幕高清在线视频| 在线视频色国产色| 久久精品成人免费网站| 中文字幕久久专区| av天堂在线播放| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日本一本二区三区精品| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲av熟女| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品电影一区二区在线| 51午夜福利影视在线观看| 观看免费一级毛片| 午夜福利在线在线| 成人午夜高清在线视频| 午夜久久久久精精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久亚洲真实| 亚洲av成人精品一区久久| 两个人的视频大全免费| 中文字幕人妻丝袜一区二区| tocl精华| 国产精品野战在线观看| 哪里可以看免费的av片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 两人在一起打扑克的视频| 欧美日韩精品网址| 久久久久久久久中文| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久久九九精品影院| 脱女人内裤的视频| 久久久久久九九精品二区国产 | 级片在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲国产看品久久| 桃红色精品国产亚洲av| 香蕉久久夜色| 亚洲av美国av| av福利片在线| 国产精品国产高清国产av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品免费视频内射| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 欧美乱妇无乱码| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产av麻豆久久久久久久| 丁香欧美五月| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产午夜精品论理片| 午夜免费观看网址| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 日本成人三级电影网站| 最近视频中文字幕2019在线8| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲自拍偷在线| 欧美乱妇无乱码| www.999成人在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 成在线人永久免费视频| 91大片在线观看| 丁香欧美五月| 免费在线观看成人毛片| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲激情在线av| 操出白浆在线播放| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久精品影院6| 99热这里只有精品一区 | 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久精品成人免费网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 免费在线观看完整版高清| 一级毛片女人18水好多| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 成人国产综合亚洲| 免费电影在线观看免费观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 成人国产一区最新在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 天天一区二区日本电影三级| 嫩草影视91久久| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲专区字幕在线| av有码第一页| 亚洲av成人精品一区久久| av国产免费在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 久久精品91蜜桃| 国产成人精品久久二区二区91| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲av美国av| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美黑人精品巨大| 亚洲在线自拍视频| 久久久国产精品麻豆| 搡老熟女国产l中国老女人| 免费观看人在逋| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 老鸭窝网址在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲av第一区精品v没综合| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 在线免费观看的www视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 九色成人免费人妻av| 看黄色毛片网站| 久久中文字幕人妻熟女| 白带黄色成豆腐渣| 国产亚洲av嫩草精品影院| 老熟妇仑乱视频hdxx| 三级毛片av免费| 久久国产乱子伦精品免费另类| 成人亚洲精品av一区二区| 午夜免费观看网址| 久久 成人 亚洲| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品福利观看| 亚洲成av人片免费观看| 男人舔女人的私密视频| 精品久久蜜臀av无| 久久精品国产清高在天天线| 国产精品野战在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 国产精品99久久99久久久不卡| 嫁个100分男人电影在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 久久久国产成人精品二区| 在线观看一区二区三区| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲精品粉嫩美女一区| 不卡av一区二区三区| 男女视频在线观看网站免费 | 女警被强在线播放| 色在线成人网| 国产片内射在线| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美黄色淫秽网站| 国产av一区二区精品久久| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日本熟妇午夜| 国产成人影院久久av| 午夜激情福利司机影院| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产片内射在线| 日韩三级视频一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲精品久久国产高清桃花| 18禁观看日本| 国产v大片淫在线免费观看| 草草在线视频免费看| 正在播放国产对白刺激| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 国内精品久久久久久久电影| 在线视频色国产色| 91大片在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 成年女人毛片免费观看观看9| e午夜精品久久久久久久| 成人av一区二区三区在线看| 精品久久久久久久末码| 国产黄片美女视频| а√天堂www在线а√下载| 国产熟女xx| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久 成人 亚洲| 久久精品综合一区二区三区| 国产探花在线观看一区二区| www.999成人在线观看| 91老司机精品| 深夜精品福利| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产成年人精品一区二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久天堂一区二区三区四区| svipshipincom国产片| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产久久久一区二区三区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 午夜成年电影在线免费观看| avwww免费| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产不卡一卡二| 老司机福利观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久亚洲精品不卡| 欧美大码av| 亚洲人成77777在线视频| 国产黄片美女视频| bbb黄色大片| 日本 av在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲七黄色美女视频| 国产午夜福利久久久久久| 成人国语在线视频| 亚洲精品色激情综合| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | av欧美777| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美zozozo另类| 午夜视频精品福利| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产成人啪精品午夜网站| 变态另类丝袜制服| 激情在线观看视频在线高清| 免费在线观看黄色视频的| av欧美777| 看片在线看免费视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 超碰成人久久| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产99久久九九免费精品| 久热爱精品视频在线9| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美性长视频在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 成人精品一区二区免费| 亚洲无线在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 欧美日韩乱码在线| 国产精品国产高清国产av| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久香蕉精品热| 99在线视频只有这里精品首页| 日韩免费av在线播放| 在线看三级毛片| 欧美在线黄色| 午夜成年电影在线免费观看| xxxwww97欧美| 无遮挡黄片免费观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产高清videossex| 99热只有精品国产| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲人成77777在线视频| 熟女电影av网| 欧美黄色淫秽网站| АⅤ资源中文在线天堂| 国产黄片美女视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 可以在线观看的亚洲视频| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲一区二区三区不卡视频| 后天国语完整版免费观看| 日本 av在线| 在线观看舔阴道视频| 两性夫妻黄色片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 人人妻人人看人人澡| 俺也久久电影网| 亚洲成人中文字幕在线播放| 丁香六月欧美| 国产成人影院久久av| 丁香欧美五月| 99国产精品99久久久久| 十八禁人妻一区二区| 国产成人系列免费观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网|