云南白鶯山地區(qū)茶樹遺傳多樣性研究

毛娟，江鴻鍵，李崇興，馬建強(qiáng)*，陳亮*

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云南白鶯山地區(qū)茶樹遺傳多樣性研究

毛娟1，江鴻鍵2，李崇興3，馬建強(qiáng)1*，陳亮1*

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；2. 云南省臨滄市人民政府茶葉辦公室，云南 臨滄 677000；3. 云南省臨滄市茶葉科學(xué)研究所，云南 臨滄 677000

云南省云縣白鶯山地區(qū)是大理茶（）、阿薩姆茶（var.）及中間過(guò)渡形態(tài)茶樹廣泛分布的區(qū)域。本研究利用30個(gè)SSR核心標(biāo)記分析了130份白鶯山地區(qū)茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性，共檢測(cè)到202個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)（）為6.73，期望雜合度（E）為0.6135，近交系數(shù)（）為－0.1745，多態(tài)信息含量（PIC）為0.5652，基因多樣性（）為0.6112。通過(guò)模擬不同樣本數(shù)量，計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)與樣本量變化的回歸曲線，發(fā)現(xiàn)樣本量在40個(gè)時(shí)，能較好地反映白鶯山茶樹資源的遺傳多樣性。研究白鶯山地區(qū)茶樹的遺傳多樣性及取樣策略，對(duì)茶樹種質(zhì)資源的保護(hù)與利用具有積極意義。

白鶯山；茶樹；SSR；遺傳多樣性

茶樹（）是最重要的飲料經(jīng)濟(jì)作物之一，廣泛種植于全球52個(gè)國(guó)家和地區(qū)[1]。云南被認(rèn)為是茶樹種質(zhì)資源類型和數(shù)量分布最多的地區(qū)[2-5]，其臨滄市北部的亞熱帶常綠闊葉林可能是大理茶（）的起源中心[6]。白鶯山位于云南省臨滄市北部，毗鄰瀾滄江，古茶樹數(shù)量多，利用歷史悠久。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然及人工選擇，白鶯山形成了大理茶、阿薩姆茶（var.）及中間過(guò)渡形態(tài)茶樹混合分布的格局。

根據(jù)形態(tài)特征，當(dāng)?shù)鼐用駥L山茶樹資源劃分為7個(gè)主要類群，包括本山茶、勐庫(kù)種、白芽子茶、賀慶茶、藤子茶、二嘎子茶及黑條子茶[7]。目前，針對(duì)白鶯山茶樹資源的研究，大多是基于上述形態(tài)學(xué)分類，如陳文雄等[8]利用RAPD標(biāo)記分析茶樹類群間的遺傳關(guān)系，推測(cè)黑條子茶和二嘎子茶可能是本山茶發(fā)生較大變異的產(chǎn)物，亦可能是本山茶與勐庫(kù)種的F1代又經(jīng)混交后繁衍數(shù)代的產(chǎn)物。趙東偉等[7]發(fā)現(xiàn)黑條子茶和二嘎子茶的形態(tài)特征與大苞茶一致，并且這兩種茶樹類群沒有獨(dú)立的分布區(qū)，總是與大理茶和茶相伴出現(xiàn)，且形態(tài)特征處于大理茶與茶的過(guò)渡狀態(tài)，推測(cè)它們可能是大理茶與茶在長(zhǎng)期栽培條件下自然雜交形成。吳華玲等[9]通過(guò)形態(tài)及葉片解剖結(jié)構(gòu)研究，將12個(gè)茶樹類群歸為二大類四小類。由于生境差異和長(zhǎng)期異交，完全依靠形態(tài)特征的茶樹類群劃分具有一定的局限性。

本研究利用30個(gè)SSR核心標(biāo)記對(duì)白鶯山地區(qū)茶樹資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并結(jié)合群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，探討了白鶯山茶樹資源遺傳特性及其類群的劃分，同時(shí)通過(guò)遺傳多樣性參數(shù)和樣本量的回歸分析，研究了最佳的采樣策略，為以白鶯山為代表的野生和地方品種茶樹種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于云南省云縣白鶯山村采集130份茶樹資源：本山茶（在植物分類上屬于典型的大理茶）53份，編號(hào)Y1-Y53；白芽子茶11份，編號(hào)Y54-Y64；二嘎子茶14份，編號(hào)Y65-Y78；賀慶茶5份，編號(hào)Y79-Y83；黑條子茶34份，編號(hào)Y84-Y117；勐庫(kù)種（在植物分類上屬于典型的阿薩姆茶）10份，編號(hào)Y118-Y127；藤子茶3份，編號(hào)Y128-Y130。采集幼嫩葉片，經(jīng)液氮處理后放至－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取及SSR基因分型

采用改良的CTAB法[10]提取基因組DNA。30個(gè)SSR核心標(biāo)記選自本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的遺傳圖譜，每個(gè)連鎖群上各2個(gè)標(biāo)記[11]。使用Applied Biosystems 9700 PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)在25?μL反應(yīng)體系中進(jìn)行：12.5?μL KAPA 2G Robust Mix，上下游引物（10?mmol·L-1）各1?μL，1?μL DNA模板，9.5?μL ddH2O。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5?min；94℃變性30?s，各種Tm退火30?s，72°C延伸1?min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5?min。PCR產(chǎn)物使用3730xl DNA分析儀進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)和基因分型。

1.3 數(shù)據(jù)分析

分別使用PopGene 1.32[12]計(jì)算觀測(cè)雜合度（e）、期望雜合度（o）和近交系數(shù)（），GenALEx 6.5[13]進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA），PowerMarker 3.25[14]計(jì)算等位基因數(shù)（）、多態(tài)信息含量（PIC）、基因多樣性指數(shù)（）、樣本間Nei′s遺傳距離，并用鄰接法（Neighbor-joining Tree, NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用Strcture 2.3.4[15]進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，Structure Harvester[16]確定最佳K值，CLUMPP[17]進(jìn)行不同K值重復(fù)抽樣分析，Distrcut[18]繪制圖形。

參考Zhao等[19]對(duì)野生大豆的研究，分析遺傳多樣性參數(shù)與樣本量的關(guān)系，分別從130份材料中隨機(jī)抽取5、10、15、20、30、40、60、90個(gè)樣本，每組隨機(jī)抽樣20次，計(jì)算每組抽樣樣本的遺傳多樣性參數(shù)平均值，及其占總樣本量遺傳多樣性參數(shù)的百分比，并用SPSS20.0[20]對(duì)抽樣樣本遺傳多樣性參數(shù)百分比與樣本量進(jìn)行曲線擬合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

30個(gè)SSR核心標(biāo)記對(duì)130份茶樹資源的遺傳多樣性分析結(jié)果如表1所示，其中共檢測(cè)到202個(gè)等位基因（），每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為3~15個(gè)，平均等位基因數(shù)為6.73。觀測(cè)雜合度（O）為0.1385~0.9154，平均值為0.5468；期望雜合度（E）為0.2459~0.8847，平均期望雜合度為0.6135，觀測(cè)雜合度小于期望雜合度，說(shuō)明在群體內(nèi)存在非隨機(jī)交配現(xiàn)象。近交系數(shù)（）為－0.6436~0.6772，平均值為－0.1745，近交系數(shù)為負(fù)，表明白鶯山茶樹資源存在雜合子過(guò)剩的現(xiàn)象。多態(tài)信息含量為0.2259~0.8695，平均值為0.5652，其中大于0.5的高多態(tài)性位點(diǎn)有20個(gè)?；蚨鄻有灾笖?shù)（）為0.2449~0.8813，平均值為0.6112。

2.2 遺傳聚類與遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖1-a所示，130份材料可劃分為類群Ⅰ和Ⅱ兩個(gè)大類群，其中類群Ⅱ又可分為Ⅱ-1和Ⅱ-2兩個(gè)小類群。使用不同顏色標(biāo)注基于形態(tài)特征劃分的7種茶樹類群，發(fā)現(xiàn)勐庫(kù)種（Y118-Y127）全部聚在類群Ⅰ，白芽子茶（Y54-Y64）和藤子茶（Y128-Y130）全部聚在類群Ⅱ-1，本山茶（Y1-Y53）全部聚在類群Ⅱ-2，二嘎子茶（Y65-Y78）、賀慶茶（Y79-Y83）和黑條子茶（Y84-Y117）主要聚在類群Ⅱ-1，并在其他類群中有零星分布。

表1 基于30個(gè)SSR核心標(biāo)記的白鶯山茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性參數(shù)

主坐標(biāo)分析顯示，130份材料可劃分為4個(gè)類群（圖2），聚類結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹基本一致，其中勐庫(kù)種全部聚在類群A，白芽子茶全部聚在類群B，本山茶全部聚在類群D，黑條子茶和二嘎子茶主要聚在類群C，其次為類群D，此外黑條子茶在類群A和B中有零星分布，而藤子茶和賀慶茶較為分散，聚集在不同的類群中。

利用Structure進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明當(dāng)K=2時(shí)，ΔK具有最大峰值，130份材料被分為兩個(gè)亞群（圖1-b）；當(dāng)K=3時(shí)，ΔK也具有1個(gè)明顯峰值，劃分為3個(gè)亞群（圖1-c）。無(wú)論K=2或K=3，本山茶均單獨(dú)成為1個(gè)亞群，而藤子茶、二嘎子茶、黑條子茶和賀慶茶均表現(xiàn)為混合遺傳結(jié)構(gòu)；在K=3時(shí)，勐庫(kù)種與白芽子茶被進(jìn)一步細(xì)分，其中勐庫(kù)種成為獨(dú)立的亞群。

2.3 取樣策略分析

對(duì)130份茶樹樣品進(jìn)行隨機(jī)抽樣，抽樣個(gè)數(shù)分別為5、10、15、20、30、40、60和90個(gè)，抽樣樣本的遺傳多樣性參數(shù)平均值見表2，遺傳多樣性參數(shù)百分比與樣本量的回歸擬合曲線如圖3所示，當(dāng)樣本量達(dá)到40個(gè)時(shí)，全部曲線進(jìn)入平臺(tái)期。以等位基因總數(shù)（a）進(jìn)行衡量，樣本量為60個(gè)時(shí)，抽樣樣本遺傳參數(shù)達(dá)到總樣本的95%左右；以有效等位基因數(shù)（e）、香農(nóng)指數(shù)（）和期望雜合度（E）進(jìn)行衡量，樣本量為30個(gè)時(shí)，抽樣樣本遺傳參數(shù)就可達(dá)到總樣本的95%。綜合分析，當(dāng)取樣量達(dá)到40個(gè)時(shí)，能較好地反映白鶯山地區(qū)茶樹資源的遺傳多樣性水平。

3 討論

3.1 白鶯山茶樹群體遺傳多樣性總體評(píng)價(jià)

微衛(wèi)星（SSR）被廣泛應(yīng)用于茶樹[21-23]及其他作物[24-26]的遺傳多樣性研究，Taniguchi等[21]利用SSR標(biāo)記分析來(lái)自14個(gè)國(guó)家和地區(qū)的788份茶樹資源，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于中國(guó)的茶樹資源遺傳多樣性最高。Yao等[22]研究了450份野生茶樹、地方品種和改良品種的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)距離茶樹起源中心越遠(yuǎn)，等位基因數(shù)、基因多樣性和PIC等遺傳參數(shù)逐漸變小，其中廣西資源基因多樣性最高（=0.636），其次為云南（=0.609）。王麗鴛等[23]對(duì)41份茶組植物進(jìn)行分析，其中37份云南樣本的基因多樣性達(dá)到0.5319。劉本英等[27-28]、周萌等[29]對(duì)云南不同類型的茶樹資源進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PIC平均值最高達(dá)0.527。與這些建立在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的研究結(jié)果相比，一個(gè)縣域范圍內(nèi)白鶯山地區(qū)的茶樹資源，具有相對(duì)較高的遺傳多樣性（=0.6112，PIC=0.5652）。

遺傳聚類和主坐標(biāo)分析結(jié)果表明，本山茶、勐庫(kù)種和白芽子茶分別單獨(dú)成為一個(gè)類群，其中白芽子茶類群具有最高的雜合度，以及最低的等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、PIC和近交系數(shù)，其近交系數(shù)為－0.9296，本山茶為0.0280，勐庫(kù)種為0.1117。近交系數(shù)為負(fù)，表明群內(nèi)雜合子過(guò)剩，近交系數(shù)越大，表明群體內(nèi)非隨機(jī)交配程度越低[30]。張穎君等[31]比較分析了白鶯山茶樹資源的生化成分差異，發(fā)現(xiàn)白芽子茶含有大理茶的特征成分大理茶素，其含量?jī)H次于本山茶（大理茶），是最接近野生大理茶的類群；同時(shí)白芽子茶的兒茶素組分、咖啡堿和茶氨酸含量介于本山茶與阿薩姆茶之間，且更接近于本山茶。吳華玲等[9]基于形態(tài)鑒定及葉片結(jié)構(gòu)解剖，將白芽子茶、勐庫(kù)大葉茶、勐庫(kù)小葉茶、豆蔑茶歸為一類，但白芽子茶的葉肉石細(xì)胞與勐庫(kù)種有明顯區(qū)別。因此，我們推測(cè)白芽子茶可能是本山茶與勐庫(kù)種雜交后代分化出的一個(gè)類群，且分離時(shí)間較短，由于奠基者效應(yīng)，表現(xiàn)出近交系數(shù)為負(fù)值的情況；另一種可能是白芽子茶是由本山茶與勐庫(kù)種通過(guò)同倍體雜交物種形成機(jī)制而產(chǎn)生的新種[32-34]。

注：a：基于Nei’s 遺傳距離構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹，b：基于Structure 的群體遺傳結(jié)構(gòu)（K=2），c：基于Structure 的群體遺傳結(jié)構(gòu)（K=3）；BSC：本山茶，BYZ：白芽子茶，EGZ：二嘎子茶，HQC：賀慶茶，HTZ：黑條子茶，MKZ：勐庫(kù)種，TZC：藤子茶。

注：BSC：本山茶，BYZ：白芽子茶，EGZ：二嘎子茶，HQC：賀慶茶，HTZ：黑條子茶，MKZ：勐庫(kù)種，TZC：藤子茶。

3.2 白鶯山茶樹根據(jù)形態(tài)特征劃分類群的合理性

目前，茶樹分類主要依據(jù)形態(tài)學(xué)特征[2-3,5]。白鶯山當(dāng)?shù)鼐用窀鶕?jù)綜合形態(tài)特征對(duì)當(dāng)?shù)夭铇滟Y源進(jìn)行了類群劃分。本研究中基于SSR的遺傳聚類分析發(fā)現(xiàn)，本山茶、勐庫(kù)種和白芽子茶能很好地與其他茶樹類群區(qū)分開，與依據(jù)形態(tài)特征劃分的類群基本一致；二嘎子茶和黑條子茶大部分聚集在一個(gè)類群，并有少量個(gè)體分散到其他類群；而賀慶茶和藤子茶分布在不同的類群中，沒有形成較為集中的聚集類群，其可能的原因是樣本量相較其他類群偏少，也可能是其形態(tài)特征與其他類群相似難以區(qū)分。吳華玲等[9]在對(duì)白鶯山茶樹資源的表型性狀調(diào)查中，將勐庫(kù)種和白芽子茶都描述為小喬木、半開張、主干不明顯、分枝低；而本研究通過(guò)遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，它們分屬于不同的亞群，因此僅依據(jù)形態(tài)學(xué)的描述，在對(duì)外形相似的茶樹資源進(jìn)行劃分時(shí)可能會(huì)有誤差。綜上所述，白鶯山當(dāng)?shù)鼐用駥?duì)茶樹資源的類群劃分具有一定合理性，大部分能夠被分子標(biāo)記證據(jù)支持，但是仍有部分茶樹的類群劃分存在爭(zhēng)議，需要進(jìn)一步綜合形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因組學(xué)等技術(shù)手段深入解析。

3.3 茶樹遺傳多樣性保護(hù)與研究的合適樣本量

遺傳多樣性被世界自然保護(hù)組織列為三大生物多樣性之一[35]。對(duì)茶樹而言，了解并保護(hù)其遺傳多樣性能夠用來(lái)避免遺傳育種中的近親繁殖及遺傳背景變窄等問題[36]。在遺傳多樣性研究與保護(hù)過(guò)程中，選擇適合的樣本量至關(guān)重要。目前，在收集和保護(hù)茶樹地方品種等資源時(shí)，樣本量一般為10~30個(gè)[6,37]。本研究結(jié)果表明，樣本量對(duì)遺傳多樣性參數(shù)有不同程度的影響，當(dāng)樣本量達(dá)到40個(gè)，各遺傳參數(shù)趨于穩(wěn)定。王麗鴛等[38]對(duì)龍井群體的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣本量達(dá)到15個(gè)，各遺傳參數(shù)就能趨于穩(wěn)定。相較白鶯山茶樹資源，龍井群體的遺傳多樣性較低，在樣本量較少時(shí)就能較好地反映其遺傳多樣性。因此，在今后的茶樹資源保護(hù)和研究中，針對(duì)遺傳多樣性較高的群體時(shí)，需要考慮擴(kuò)大樣本數(shù)量。

致謝：

臨滄市人民政府茶葉辦公室李文雄主任、盧錦春科長(zhǎng)，臨滄市云縣茶葉辦公室左成琳主任在資源收集過(guò)程中給予了莫大幫助，謹(jǐn)此致謝！

.表2不同抽樣樣本的遺傳多樣性參數(shù)比較

Table 2 Comparison of genetic parameters of tea populations with different sample sizes

圖3 遺傳多樣性參數(shù)百分比值隨樣本量變化的擬合回歸曲線

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Genetic Diversity Analysis of Tea Plant in Baiyingshan Mountain of Yunnan

MAO Juan1, JIANG Hongjian2, LI Chongxing3, MA Jianqiang1*, CHEN Liang1*

1. Key Laboratory of Tea Plant Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Tea Administration Office of Lincang, Lincang 677000, China; 3. Tea Research Institute of Lincang, Lincang 677000, China

Tea germplasms includingvar., wild and semi-wild, and interspecific hybrid populations of the aforesaid species, are widely distributed in Baiyingshan Mountain of Yunnan Province. In this study, a core set of SSR markers were employed to assess the genetic diversity of tea germplasms derived from Baiyingshan Mountain. The results showed that a total of 202 alleles were detected, and the average number of allele () per SSR was 6.73, and 0.6135 for the average of expected heterozygosity (E), －0.1745 for the mean of inbreed coefficient (). The polymorphic information content (PIC) and gene diversity () were estimated to be 0.5652 and 0.6112 on average, respectively. The regression curves of genetic parameters influenced by population size showed that it could reach an optimized coverage of genetic diversity as the sample size was higher than 40. Investigation of the genetic diversity of tea germplasms in Baiyingshan Mountain was of vital importance for protection and utilization of these resources in the future.

Baiyingshan, tea plant, SSR, genetic diversity

S571.1；Q52

A

1000-369X(2018)01-069-09

2017-04-05

2017-08-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.31500568）、國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-023）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2017-TRICAAS）

毛娟，女，碩士研究生，主要從事茶樹資源育種研究。*通訊作者