異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用及機(jī)理研究

高春霞 劉俊義 謝從坤 鄧紅 李涵 袁莉

摘要：研究了異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性，并初步探究了其抑菌機(jī)理，為開發(fā)高效低毒的抗菌藥物提供理論依據(jù)。首先，采用濾紙片法測定異葒草素抑菌圈大小和抑菌率來確定異葒草素的抑菌活性；其次，再通過繪制生長曲線、測定細(xì)胞膜通透性和細(xì)胞內(nèi)容物滲漏、總核酸來分析異葒草素的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，異葒草素濃度與對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌率呈正相關(guān)；其抑菌機(jī)理可能是由于異葒草素抑制了細(xì)菌對數(shù)生長期的分裂速度，并導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性增加和細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外漏，影響細(xì)菌生長代謝，從而致死菌體細(xì)胞。上述結(jié)果說明，異葒草素作為天然抗菌劑有較好的開發(fā)應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：異葒草素；抑菌活性；機(jī)理

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2018.03.016

文章編號(hào)：1671-9646（2018）03a-0050-05

Abstract：This research showed the antibacterial activity of isoorientin on Salmonella typhimurium and its antibacterial mechanism，which provided a theoretical basis for the development of high efficiency and low toxicity antibacterial drugs. The size of inhibition zone and the rate of inhibition were determined by filter paper method to determine the antibacterial activity of isoorientin. Antibacterial mechanism of isoorientin was analysed by drawing growth curve and determining the cell membrane permeability and leakage of intracellular solution（water soluble protein and total nucleic acid）. The results showed that isoorientin concentration rate was positively correlated with inhibition of S. typhimurium. Antibacterial mechanism of isoorientin might be the inhibition of bacteria in logarithmic growth phase splitting speed which led to the increase of cell membrane permeability and the leakage of electrolyte inside the cell. The growth and metabolism of bacteria were affected and finally caused cell death. The results indicated that isoorientin has the potential of exploitation and application as natural antibacterial agent.

Key words：isoorientin；antibacterial activity；mechanism

0 引言

異葒草素（Isoorientin），又名3'，4'，5，7 -四羥基- 6 -吡喃葡萄糖基黃酮，是一種天然的黃酮類物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)式如圖1，因最早從葒草中分離發(fā)現(xiàn)而得名[1]。異葒草素主要存在于玉米、黑蕎麥、竹筍、苦菜、山楂、百香果、西番蓮等食物中[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，異葒草素具有清除自由基[4]、抑制癌細(xì)胞增殖[5-6]、抗氧化[7-8]、抗炎[9-10]、保肝[11-13]、調(diào)節(jié)免疫能力[14]等生物活性。天然抗菌成分一般為多酚或黃酮類物質(zhì)，提取物己經(jīng)廣泛用于抑菌劑[15]，異葒草素作為一種水溶性黃酮，其對微生物的作用至今鮮有報(bào)道。試驗(yàn)以鼠傷寒沙門氏菌為供試菌，通過研究異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果、抑菌圈大小、最小抑菌濃度、生長曲線、蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞膜通透性及核酸含量等方面的變化來闡述異葒草素的抑菌效果及作用機(jī)制，為開發(fā)高效低毒的抗菌藥物提供理論依據(jù)。

異葒草素結(jié)構(gòu)式見圖1。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），陜西師范大學(xué)食品微生物專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

異葒草素，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司提供，含量99%；NA培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂粉分析純試劑，均購于西安晶博化玻儀器供應(yīng)站；AO，EB雙染試劑盒，購于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；考巴斯亮藍(lán)G-250，購于西安晶博化玻儀器供應(yīng)站。

1.3 主要儀器

GHP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海申賢恒溫設(shè)備廠產(chǎn)品；THZ-C型恒溫振蕩器，江蘇省太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；Multiskan Go型全波長酶標(biāo)儀，美國熱電公司產(chǎn)品；DDSJ-308A型電導(dǎo)率儀、超凈工作臺(tái)，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；BS- 224-S型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；LDZX-50KB型上海申安立式滅菌器、DF- 101S型恒溫磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；徠卡Leica AF6000型熒光顯微鏡系統(tǒng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 異葒草素抑菌效果的測定

采用濾紙片擴(kuò)散法[16-17]進(jìn)行測定。準(zhǔn)確吸取100 μL受試菌懸液注入到冷凝培養(yǎng)基平板表面，并在平板表面等距貼放4～5個(gè)濾紙片（121 ℃，30 min滅菌），中間濾紙片添加無菌水為空白，兩邊濾紙片分別添加5 μL的一定濃度異葒草素溶液，于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h。用十字交叉法測量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，結(jié)果用mm表示。抑菌率的計(jì)算公式為：

1.4.2 異葒草素對菌體生長曲線的影響

采用分光光度法測定異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌生長速度的影響[18-19]。其方法為：取出處于對數(shù)生長期的細(xì)菌，并分別加入異葒草素使其終濃度為 1 mmol/L，以轉(zhuǎn)速180 r/min搖床37 ℃的條件恒溫培養(yǎng)，每隔2 h取樣測量OD600，連續(xù)測定24 h，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，用蒸餾水代替異葒草素溶液作為對照試驗(yàn)，繪制出異葒草素作用下鼠傷寒沙門氏菌的生長曲線。

1.4.3 異葒草素對菌體細(xì)胞膜通透性的影響

通過相對電導(dǎo)率法[20]和AO-EB染色法[21]測定電導(dǎo)率，從而測定異葒草素對菌體細(xì)胞膜通透性的影響。

（1）測定相對電導(dǎo)率。用PBS清洗活化后的菌體并使之混勻。并分別加入異葒草素使其終濃度為1 mmol/L。取3 mL，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，取上清液待用。菌懸液置于37 ℃，120 r/min 的搖床中，每隔2 h取1次，離心，取上清液3 mL測此時(shí)電導(dǎo)率；然后100 ℃熱死處理，離心測定上清液的電導(dǎo)率值，以蒸餾水替代異葒草素溶液作為空白對照[17]。

其相對滲透率的計(jì)算公式為：

式中：K——某時(shí)間電解質(zhì)相對滲透率，%；

J0——零時(shí)間電導(dǎo)率，ms/cm；

J1——某時(shí)刻的電導(dǎo)率，ms/cm；

J2——煮沸20 min，冷卻至室溫后電導(dǎo)率，

ms/cm。

（2）AO-EB染色法。PBS清洗活化后處于生長期的菌體，取5 mL，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心5 min，取上清，PBS重懸，重復(fù)2次；并分別加入異葒草素使其終濃度為1 mmol/L，混勻；放入培養(yǎng)箱中37 ℃振蕩保存6 h；取出后離心，棄PBS，各加入10 μL AO、EB染液，取10 μL樣品置于載玻片，蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖片。以蒸餾水代替異葒草素溶液作為空白對照。

1.4.4 異葒草素對菌體可溶性蛋白質(zhì)的影響

用考馬斯亮藍(lán)比色法[22]測定異葒草素對受試菌菌體可溶性蛋白質(zhì)含量的影響[18]。其方法為：菌體活化后用PBS清洗3次，混勻。加入并分別加入異葒草素，使其終濃度為1 mmol/L。菌懸液置于37 ℃，120 r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔2 h取樣，離心，取上清液，加入考馬斯亮藍(lán)試劑于595 nm處測樣品管的吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）查得待測樣品的蛋白質(zhì)含量。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，蛋白含量為縱坐標(biāo)，繪制蛋白含量變化曲線，以蒸餾水作為空白對照。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

1.4.5 異葒草素對鼠傷寒總核酸泄露的影響

用PBS清洗活化后處于生長期的受試菌株，并分別加入異葒草素使其終濃度為1 mmol/L，混勻，37 ℃，100 r/min環(huán)境下恒溫培養(yǎng)。每2 h取樣1次，將取樣液3 000 r/min離心15 min，取上清液加入96孔板用酶標(biāo)儀測量260 nm下的吸光度并記錄數(shù)據(jù)，以蒸餾水作對照組，每組平行3次，取平均值[23]。

2 結(jié)果與討論

2.1 異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌抑菌效果的測定 結(jié)果

異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌抑菌效果見圖3，異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌DIZ的檢測結(jié)果（X±s，n=5）見表1。

由表1可知，異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌有一定的抑制效果，且隨著異葒草素濃度的增加，抑菌效果有一定的增強(qiáng)。當(dāng)異葒草素的濃度增加到30 mmol/L時(shí)，抑菌圈直徑和抑菌率達(dá)到最大，抑菌圈直徑為15.5±0.41 mm，抑菌率為91.36%。這說明異葒草素有著一定的抑菌能力，且高濃度的異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌有著較強(qiáng)的抑制作用。

2.2 異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌菌體生長曲線影響的結(jié)果

按照分光光度法測定異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌生長速度的影響。

異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌生長曲線的影響見圖4。

由圖4可以看出，隨著時(shí)間的增加，空白和加藥組的吸光度值都是不斷增加的，但增加的速度有所差別，空白組在0～14 h內(nèi)，吸光值不斷增加，在14～26 h內(nèi)吸光值趨于平穩(wěn)，說明在有限的生存空間和營養(yǎng)條件下，細(xì)菌的數(shù)量已經(jīng)達(dá)到了最大值。而加藥組，在0～2 h內(nèi)，細(xì)菌生長速度與空白組相差不大，在2～18 h內(nèi)吸光度值不斷升高，但細(xì)菌生長速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于空白組，這說明異葒草素破壞了細(xì)菌正常的生長周期和細(xì)菌的細(xì)胞分裂；18～26 h內(nèi)，吸光度值趨于平穩(wěn)，在16～26h內(nèi)空白組與加藥組的吸光度值之差逐漸減小。加藥組與空白組相比結(jié)果可以說明異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌的的菌體生長周期及細(xì)胞分裂有一定的抑制作用[24]，且隨著抑菌時(shí)間的增加，抑制作用逐漸降低。

2.3 異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌菌體細(xì)胞膜通透性的影響結(jié)果

按照相對電導(dǎo)率法進(jìn)行試驗(yàn)，異葒草素對受試菌電導(dǎo)率的影響試驗(yàn)。

異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌電導(dǎo)率的影響見圖5。

由圖5可以看出，加入異葒草素的受試菌體細(xì)胞的相對滲透率明顯高于對照組。隨著異葒草素對菌體作用時(shí)間的延長，受試菌體細(xì)胞的相對滲透率持續(xù)增加，且處理2 h后受試菌體細(xì)胞的相對滲透率變化的速率明顯升高，說明經(jīng)過異葒草素處理的菌體細(xì)胞隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)K+，Na+等電解質(zhì)的滲出量不斷增大，這些離子的丟失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的環(huán)境被破壞、細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低、多種代謝途徑受阻和多種酶的活性受到影響，以及細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的調(diào)節(jié)能力下降，使細(xì)胞失水或吸脹，從而起到抑菌作用[25]。8 h后相對滲透率逐漸持平，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

AO-EB熒光染色結(jié)果見圖6。

吖啶橙（AO）能透過胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光。溴乙錠（EB）僅能透過胞膜受損的細(xì)胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。因此，可以根據(jù)AO/EB熒光標(biāo)記觀察細(xì)胞形態(tài)和膜完整性。異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌形態(tài)的影響如圖6所示。對照組菌體呈綠色，具有完整的膜結(jié)構(gòu)；異葒草素處理組部分菌體呈橘紅色熒光，該結(jié)果可進(jìn)一步證明，異葒草素處理可通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜完整性，進(jìn)而抑制細(xì)菌生長。

2.4 異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌菌體可溶性蛋白質(zhì)的影響測定結(jié)果

按照考馬斯G250法測定，異葒草素對菌體可溶性蛋白質(zhì)的影響測定結(jié)果。

異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌蛋白的影響見圖7。

菌體內(nèi)的可溶性蛋白主要是參與代謝的各種酶類，菌體在生長過程中會(huì)產(chǎn)生分泌性蛋白，這些蛋白會(huì)通過滲透作用穿過細(xì)胞膜進(jìn)入到菌液中，測量其含量可了解菌體細(xì)胞內(nèi)總代謝的變化[26-27]。由圖7可知，經(jīng)異葒草素處理后，受試菌液中可溶性蛋白質(zhì)含量下降。處理2 h 后可溶性蛋白質(zhì)含量下降較為明顯，處理8 h 后，受試菌液中可溶性蛋白質(zhì)含量基本保持不變，其原因可能為隨著處理時(shí)間的增加異葒草素的抑菌效果降低，同時(shí)有部分菌體繼續(xù)生長代謝產(chǎn)生可溶性蛋白。研究表明，異葒草素可抑制受試菌體中蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而產(chǎn)生抑菌作用，當(dāng)處理時(shí)間為8 h時(shí)抑制效果最為明顯。

2.5 異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌總核酸泄露的影響測定結(jié)果

異葒草素對鼠傷寒沙門氏菌總核酸的影響見 圖8。

由圖8可以看出，空白組菌液中核酸含量相當(dāng)且始終保持不變，而異葒草素處理組菌液中吸光度值逐漸增加，且在作用后2 h達(dá)到最大值，之后趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明，異葒草素作用可嚴(yán)重破壞細(xì)菌細(xì)胞膜通透性和完整性，使細(xì)菌內(nèi)部的核酸穿過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)菌外部菌液中。

3 結(jié)論

濾紙片法試驗(yàn)結(jié)果表明，異葒草素鼠傷寒沙門氏菌有較強(qiáng)的抑制效果，且異葒草素濃度與對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果有正相關(guān)關(guān)系。通過測定菌體生長曲線、電導(dǎo)率、生長代謝、細(xì)胞膜通透性、菌體蛋白質(zhì)含量和菌體總核酸的泄露，初步弄清了異葒草素對菌體細(xì)胞的抑制機(jī)制。異葒草素不僅使菌體蛋白質(zhì)合成的速度受到抑制，菌體總核酸泄露嚴(yán)重，還使菌體細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，最終導(dǎo)致受試菌體內(nèi)電解質(zhì)滲漏，細(xì)菌增殖被抑制，菌體死亡。

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