細(xì)胞自噬的分子調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展*

李 媛，高維娟

（1.承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德 067000；2.河北中醫(yī)學(xué)院/河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

細(xì)胞自噬是目前生物醫(yī)學(xué)廣泛研究的熱點(diǎn)之一，它是一種由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)成分自我降解的過程，是真核生物中一種普遍的生命現(xiàn)象。在真核細(xì)胞中，自噬處在一個(gè)較低的水平上，起到持家的作用，例如降解胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及無功能蛋白，以此作為細(xì)胞內(nèi)能量的來源，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。自噬的上調(diào)出現(xiàn)在外部壞境的改變，如饑餓、激素失衡和氧化應(yīng)激等，或者是內(nèi)部需求的增加，如去除蛋白質(zhì)聚集體等情況[1-2]。越來越多的證據(jù)表明，自噬與心臟病、癌癥和許多神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。據(jù)Hundeshagen等[3]報(bào)道，地高辛在治療心衰的過程中可明顯激活自噬；但在永久性大腦中動(dòng)脈栓塞模型中，自噬過度激活可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生死亡，加重腦損傷[4]。自噬在疾病中的作用比較復(fù)雜，因此，明確自噬的發(fā)生機(jī)制，有助于誘導(dǎo)自噬在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮保護(hù)作用。為此，本文對(duì)細(xì)胞自噬的過程及其分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行闡述。

1 自噬的概念及分類

自噬現(xiàn)象普遍存在于真核細(xì)胞生物中，在自噬調(diào)控基因的作用下，利用溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)受損、衰老的細(xì)胞器，長(zhǎng)壽蛋白及入侵的病原體等物質(zhì)，被新月型的囊泡結(jié)構(gòu)包裹，形成自噬體；自噬體再與溶酶體結(jié)合，形成自噬溶酶體；而自噬溶酶體內(nèi)可釋放多種組織蛋白酶，對(duì)包裹的物質(zhì)進(jìn)行降解、消化，轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x的氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)，為細(xì)胞的再生和修復(fù)提供必要的原料，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的循環(huán)和再利用。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在三種自噬類型，根據(jù)功能和進(jìn)入溶酶體的途徑分為巨自噬、小自噬及分子伴侶介導(dǎo)的自噬。通常所說的自噬泛指巨自噬，由雙層膜結(jié)構(gòu)包裹細(xì)胞內(nèi)容物后再與溶酶體融合；小自噬是指溶酶體膜直接內(nèi)陷、包裹細(xì)胞內(nèi)容物；分子伴侶介導(dǎo)的自噬具有選擇性，由分子伴侶識(shí)別帶有特定序列的蛋白底物，再與溶酶體融合。盡管三種自噬的方式不相同，但最終都與溶酶體相融合，形成自噬溶酶體，并在其內(nèi)消化、降解。

2 自噬的過程

自噬是一個(gè)高度管制且具有完整周期的多步驟過程，一般分三個(gè)步驟：自噬啟動(dòng)階段、延伸與成熟階段、降解階段[5]。透射電子顯微鏡是觀察、辨認(rèn)自噬各個(gè)階段的最主要方法。

2.1 自噬的啟動(dòng) 目前，與細(xì)胞自噬相關(guān)的30多種特異性基因在酵母菌中已成功取得并鑒定，被統(tǒng)一命名為自噬相關(guān)基因(autophagy-telated gene，ATG)。自噬的起始是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)整合胞外的刺激信號(hào)，由ATG1/ULK1(哺乳動(dòng)物中酵母菌ATG1的同系物)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體膜等結(jié)構(gòu)上誘發(fā)，在Beclin 1-Vps34復(fù)合物的作用下，誘導(dǎo)自噬初始囊泡的形成[6]。雖然自噬體膜的起源尚有爭(zhēng)議，但大部分學(xué)術(shù)研究?jī)A向于自噬體膜來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜或高爾基體。而Beclin 1-Vps34復(fù)合物由自噬基因Beclin 1、Vps34(哺乳動(dòng)物磷酸酰肌醇-3激酶在酵母菌中的同系物)組成，同時(shí)也引導(dǎo)自噬蛋白的定位。

2.2 自噬的延伸與成熟 在哺乳動(dòng)物和酵母菌中，許多ATG是保守、相似的，并且通過泛素化結(jié)合到自噬體膜上。兩個(gè)泛素化的共軛系統(tǒng)，ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物和微管相關(guān)蛋白質(zhì)輕鏈3(LC3)-磷脂酰乙醇胺(PE)復(fù)合物共同作用于自噬囊泡，促進(jìn)自噬體膜的延伸[7-8]。其中，ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物由ATG7和ATG10催化形成，LC3-PE復(fù)合物的形成過程亦與ATG7密切相關(guān)。LC3在ATG4的作用下脫羥基，生成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ先存在于細(xì)胞質(zhì)中，隨后被ATG7及ATG3共同介導(dǎo)，與PE相結(jié)合，酯化形成LC3-Ⅱ；LC3-Ⅱ定位到自噬體膜上，是自噬體形成的生物學(xué)標(biāo)志[9]。

2.3 自噬體的降解階段 一般情況下，自噬體膜與溶酶體膜的融合由SNARE(膜融合事件中所涉及的小蛋白超家族)蛋白調(diào)節(jié)。SNARE蛋白包括突觸融合蛋白STX17(Syntaxin17)、突觸囊泡相關(guān)膜蛋白VAMP8(synaptic vesicle-associated membrane protein)、突觸相關(guān)蛋白SNAP29(synaptosome-associated protein of 29kD)等[10]。STX17可以定位到成熟的自噬體膜上，通過胞質(zhì)中的SNAP29與溶酶體膜上的VAMP8相互作用，啟動(dòng)膜的融合，形成自噬溶酶體[3]。融合后，自噬體內(nèi)容物在一系列溶酶體水解酶的作用下被降解，降解產(chǎn)物通過溶酶體透性膜轉(zhuǎn)到胞液中，被機(jī)體重新利用。

3 自噬的分子調(diào)控機(jī)制

自噬的產(chǎn)生是由多條信號(hào)通路共同介導(dǎo)來完成的，其中mTOR、Beclin 1等是多條信號(hào)通路的交叉點(diǎn)，是調(diào)控自噬的關(guān)鍵因素。

3.1 mTOR通路 mTOR是進(jìn)化上十分保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)蛋白激酶類家族。mTOR通路是調(diào)節(jié)自噬的主要信號(hào)通路，它是多條信號(hào)通路的匯聚點(diǎn)，亦是目前研究最多的一條通路。mTOR可接受多種信號(hào)的刺激，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和自噬過程中起著非常重要的作用。

3.1.1 mTOR復(fù)合物的組成：mTOR存在兩種不同的形式：（1）對(duì)雷帕霉素敏感的復(fù)合物mTORC1，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡及能量代謝和自噬；（2）對(duì)雷帕霉素不敏感的復(fù)合物mTORC2，主要參與細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞的存活。mTORC1由多重蛋白組成，其中包括MLST8(mammalian lethal with SEC13 protein 8)、DEPTOR(DEP domain-containing mTOR-interacting protein)、RAPTOR(regulatory associated protein of mTOR)、PRAS40(proline-rich Akt substrateof 40 kDa)[4]。

3.1.2 mTORC1及其下游分子對(duì)自噬的調(diào)節(jié)：自噬起始復(fù)合物ULK(UNC-51-like kinase)在哺乳動(dòng)物中由ULK1、Atg13、FIP200(FAK family kinase-interacting protein of 200 kD)和Atg101組成，mTORC1通過與ULK復(fù)合物相互作用，將外界信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞自噬特異性信號(hào)[11]。在機(jī)體能量充足的情況下，活化的mTORC1可使mAtg13和ULK1高度磷酸化，從而抑制自噬的發(fā)生。相反，當(dāng)機(jī)體處于饑餓、氧化應(yīng)激等狀態(tài)時(shí)，mTORC1與ULK復(fù)合物分離，mAtg13迅速去磷酸化，并與ULK1結(jié)合，形成誘導(dǎo)自噬的復(fù)合體，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[8，12]。

3.1.3 mTORC1及其上游分子對(duì)自噬的調(diào)節(jié)：

3.1.3.1 PI3K-Akt-mTORC1信號(hào)通路：PI3K是酵母菌Vsp34的同源基因，胰島素樣生長(zhǎng)因子可激活PI3K，在磷脂酰肌醇脂依賴性蛋白激酶1的協(xié)同作用下，激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)，Akt也可直接磷酸化PRAS40，使PRAS40從mTORC1解離下來，解除其對(duì)mTORC1的抑制作用，允許mTORC1磷酸化下游底物，抑制自噬的啟動(dòng)?；罨腁kt也可直接作用于結(jié)節(jié)性硬化蛋白2(tuberous sclerosis protein 2，TSC2)，抑制TSC1/2復(fù)合物，使其失活。RHEB是Ras蛋白家族中的一員，具有GTP酶活性，TSC2作為GTP酶的催化劑，能使有活性的RHEB-GTP轉(zhuǎn)化為無活性的RHEB-GDP。磷酸化的TSC2的活性降低，使其下游底物RHEB-GTP增多，RHEB-GTP可激活mTORC1，從而抑制自噬[6]。

3.1.3.2 AMPK-mTOR信號(hào)通路：AMP激活性蛋白激酶AMPK（AMP-activated protein kinase）是細(xì)胞內(nèi)能量的傳感器，當(dāng)ATP/AMP比率降低或能量需求增加時(shí)，AMPK被激活，活化的AMPK通過激活TSC1/2復(fù)合物對(duì)mTORC1起到抑制作用，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。AMPK也可以直接作用于RAPTOR，使其與mTORC1分離，解除對(duì)mTORC1的抑制作用[13-14]。

3.2 Beclin 1通路 Beclin 1是酵母菌ATG6/VSP30在哺乳動(dòng)物的同源基因，亦是最早被發(fā)現(xiàn)的參與自噬調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。Beclin 1具有三個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域：BH3、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CCD)和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域(ECD)。Beclin 1可通過這些結(jié)構(gòu)域與多種蛋白結(jié)合，形成復(fù)合體，作為分子反應(yīng)的“平臺(tái)”，可誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位到自噬體膜上，調(diào)控自噬的形成與成熟[15]。

參與Beclin 1復(fù)合物組成的蛋白主要包括Vps34、UVRAG、Ambral和Bcl-2。Vps34是哺乳動(dòng)物III型PI3K的一種，可與Beclin 1的ECD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成Vps34-Beclin 1復(fù)合體，促進(jìn)自噬體膜的形成與轉(zhuǎn)運(yùn)。UVRAG為抗紫外線相關(guān)基因的產(chǎn)物蛋白，若直接與Beclin 1的CCD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，可促進(jìn)自噬體的成熟，而其亞單位Rubicon與Beclin 1結(jié)合，則抑制自噬體的成熟[16-17]。Ambral是新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，對(duì)依賴Beclin 1的自噬有正面調(diào)節(jié)作用，游離的Ambral與Beclin1結(jié)合，能促進(jìn)細(xì)胞自噬囊泡膜的集聚，誘導(dǎo)自噬的形成[18]。目前研究顯示，細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Bcl-2也是重要的自噬調(diào)節(jié)蛋白，Bcl-2含有與Beclin 1相同的結(jié)構(gòu)域BH3，Bcl-2可通過此結(jié)構(gòu)域與Beclin 1結(jié)合，并相互作用，減弱Beclin 1與Vps34的相互作用，使其它自噬相關(guān)蛋白難以結(jié)合到自噬體膜上，從而抑制自噬的發(fā)生[19]。

由此可見，Beclin 1可在自噬體形成的每個(gè)重要階段進(jìn)行干預(yù)，這種現(xiàn)象是通過不同蛋白與Beclin 1結(jié)合或分離實(shí)現(xiàn)的。而它們的結(jié)合與分離具有一定的組織依賴性，可能跟這些蛋白與Beclin 1的結(jié)合是短暫的、相對(duì)不穩(wěn)定的或只發(fā)生在特定的條件下有關(guān)。

3.3 其它分子對(duì)自噬的調(diào)節(jié) 除上述信號(hào)通路外，還有其它分子參與細(xì)胞自噬的發(fā)生。游離氨基酸可負(fù)反饋調(diào)節(jié)自噬，在機(jī)體內(nèi)氨基酸充足的情況下，可抑制自噬的發(fā)生。自噬亦可通過轉(zhuǎn)錄因子家族中的FOXO在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)，F(xiàn)OXO蛋白是自噬的活性調(diào)節(jié)因子，可激活多種自噬基因，如Gabarap11、Map1LC3、ATG5、ATG12、Vps34和Beclin 1等的表達(dá)[3]。此外，由于p53基因在細(xì)胞中的定位不同，可表現(xiàn)出對(duì)自噬調(diào)節(jié)的雙重作用：細(xì)胞核內(nèi)的p53在正常情況下處于失活狀態(tài)，當(dāng)受外界刺激時(shí)，其絲氨酸和賴氨酸的殘基磷酸化和乙?；患せ睿罨膒53可抑制自噬的負(fù)調(diào)節(jié)因子mTOR，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生；而存在于細(xì)胞質(zhì)中的p53，主要通過抑制AMPK活性和激活mTOR來抑制自噬的發(fā)生[20]。

4 結(jié)語(yǔ)

自噬是真核細(xì)胞中普遍存在又十分重要的生命現(xiàn)象，與細(xì)胞的生命活動(dòng)息息相關(guān)。自噬具有與泛素-蛋白酶體相似的作用，可以降解蛋白質(zhì)，達(dá)到回收再利用的目的。它們的不同點(diǎn)是泛素-蛋白酶體途徑主要負(fù)責(zé)短壽命蛋白質(zhì)的降解，而自噬則主要降解長(zhǎng)壽蛋白，以及受損、衰老的細(xì)胞器。近年來，自噬的研究取得了突破性的進(jìn)展，許多疾病與自噬密切相關(guān)，但自噬在疾病中扮演的角色、發(fā)揮的作用尚未完全清楚。細(xì)胞自噬受多種信號(hào)調(diào)控，深入探討這些機(jī)制將為尋找調(diào)控自噬的靶點(diǎn)提供重要依據(jù)。正確認(rèn)識(shí)自噬在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，利用自噬的有利因素消除不利因素，自噬通路的藥理調(diào)制將是臨床醫(yī)生治療人類疾病的一個(gè)新的挑戰(zhàn)。

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