膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型研究進(jìn)展*

張君濤,吳超超 綜述,張棟林△,張 超 審校

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，天津 300380；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300193)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)又被稱(chēng)為膝關(guān)節(jié)退行性骨關(guān)節(jié)病，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生，關(guān)節(jié)變形及關(guān)節(jié)周?chē)M織功能減退等，是臨床常見(jiàn)危害老年人健康的骨關(guān)節(jié)疾病，給社會(huì)增加沉重的負(fù)擔(dān)。但其發(fā)病機(jī)制仍不明確，臨床上也沒(méi)有特異性的治療措施，只能緩解癥狀，所以建立骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型來(lái)探索其發(fā)病機(jī)制和防治手段成為科研熱點(diǎn)。KOA動(dòng)物模型從造模方式上可分為手術(shù)方式、非手術(shù)方式、自發(fā)模型3類(lèi)，本文就這3類(lèi)KOA動(dòng)物模型的研究近況做一綜述。

1 手術(shù)方法

1.1關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)

1.1.1Hulth法 Hulth法是KOA手術(shù)造模的經(jīng)典方法。蘇達(dá)明等[1]采用Hulth法，切斷膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶和前后交叉韌帶，并整體切除內(nèi)側(cè)半月板，造模后6 周行X線(xiàn)檢查證明成功建立兔KOA模型。肖春茍等[2]切除兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板和切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，術(shù)后1周強(qiáng)迫活動(dòng)，4周成功復(fù)制兔KOA模型。

1.1.2前交叉韌帶切斷法 此法較Hulth法對(duì)動(dòng)物創(chuàng)傷和生理結(jié)構(gòu)改變小，能較全面反映 KOA 軟骨退變的病理進(jìn)程,是近年建立 KOA 動(dòng)物模型采用較多的方法[3]。王君等[4]采用前交叉韌帶切斷(ACLT)法造模，造模3 d后，將實(shí)驗(yàn)兔術(shù)肢對(duì)側(cè)肢體固定于腹部增加術(shù)肢負(fù)重，聯(lián)合強(qiáng)制運(yùn)動(dòng)，4 周即可造模成功,此模型符合 KOA 臨床特征，且造模時(shí)間較單純ACLT模型時(shí)間短。

1.1.3半月板切除法 半月板具有穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)，緩沖壓力負(fù)荷，減少關(guān)節(jié)摩擦等作用，缺失可造成膝關(guān)節(jié)磨損，誘發(fā)KOA樣改變。BAGI等[5]采用切除大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板的方法，10 周后影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)局部軟骨受損和骨贅形成等KOA樣改變，成功建立大鼠KOA模型。陳康等[6]應(yīng)用兔單后肢雙側(cè)半月板切除聯(lián)合前交叉韌帶橫斷法，術(shù)后第2、6、10 周后大體觀察和術(shù)肢標(biāo)本病理改變都符合典型的KOA特征。

1.1.4軟骨缺損法 軟骨缺損法造?？奢^好地觀察膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展及修復(fù)進(jìn)程。但研究者發(fā)現(xiàn)，軟骨缺損直徑小于3 mm，缺損深度未至軟骨下骨，制模術(shù)后6周，缺損的軟骨可獲得局部或完全修復(fù)，這樣，在造模研究中，材料的誘導(dǎo)作用有與膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)，之間的相關(guān)性就難以得到證明[7]。趙森泉等[8]為探討何種運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度以促進(jìn)膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的修復(fù)采用在大鼠股骨面作一直徑3.2 mm的全層軟骨缺損方式造模，造模1周后選擇低、中、高3種運(yùn)動(dòng)干預(yù)，連續(xù)8周后，血清基質(zhì)金屬蛋白酶3、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑濃度及番紅染色結(jié)果顯示，中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)干預(yù)更加有助于提高軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨缺損部位的修復(fù)，增加修復(fù)效果。

1.2關(guān)節(jié)外誘導(dǎo)

1.2.1改變關(guān)節(jié)應(yīng)力 膝關(guān)節(jié)內(nèi)的正常應(yīng)力環(huán)境對(duì)關(guān)節(jié)軟骨保持正常生理特性有重要的意義，關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)力增加或減小均可成功誘導(dǎo)建立KOA動(dòng)物模型。楊松濱等[9]采用手術(shù)切斷內(nèi)側(cè)副韌帶并切除部分髕韌帶的方法造模，造模4、8周時(shí)模型組動(dòng)物血清中白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13水平均升高,較對(duì)照組有顯著差異，表明切斷內(nèi)側(cè)副韌帶并切除部分髕韌帶的方法可獲得較為理想的兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型。余存泰等[10]在兔膝關(guān)節(jié)間隙上下各鉆入1根克氏針,一組撐開(kāi)克氏針兩端建立關(guān)節(jié)低壓應(yīng)力動(dòng)物模型，另一組拉緊克氏針兩端建立關(guān)節(jié)高應(yīng)力動(dòng)物模型，術(shù)后管型石膏伸直位固定術(shù)肢，發(fā)現(xiàn)低壓應(yīng)力模型首先出現(xiàn)軟骨細(xì)胞功能減退,軟骨細(xì)胞代償性增生,然后基質(zhì)破壞,最終誘發(fā)軟骨整體退變；高壓應(yīng)力模型退變首先表現(xiàn)為軟骨基質(zhì)破壞，同時(shí)軟骨細(xì)胞代償性增生，然后軟骨細(xì)胞退變，最終導(dǎo)致整個(gè)關(guān)節(jié)軟骨退變。

1.2.2破壞關(guān)節(jié)血液循環(huán) 膝關(guān)節(jié)血液循環(huán)改變是膝關(guān)節(jié)退變的影響要素之一。吳并生等[11]采用手術(shù)分離并結(jié)扎兔單側(cè)股靜脈的方法,造成股骨內(nèi)高壓狀態(tài)，術(shù)后強(qiáng)迫活動(dòng)，12周建立了符合早期KOA病理改變的動(dòng)物模型。戴七一等[12]采用手術(shù)結(jié)扎并切斷兔單側(cè)臀下靜脈、股靜脈、大隱靜脈的方式，造成股骨內(nèi)高壓誘發(fā)膝關(guān)節(jié)退變，在造模術(shù)后 8 周獲得早中期兔KOA模型。

1.2.3卵巢切除 切除雌性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物卵巢致雌性激素缺乏可成功誘發(fā)KOA動(dòng)物模型[13]。因此，王文勝等[14]采用卵巢切除聯(lián)合跑步建立大鼠膝KOA模型，造模4周時(shí)模型+上坡跑步組Mankin評(píng)分已達(dá)損傷標(biāo)準(zhǔn)，而模型+下坡組Mankin評(píng)分達(dá)損傷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間為造模6周，動(dòng)態(tài)觀察表明卵巢切除聯(lián)合上坡疲勞跑臺(tái)訓(xùn)練較單純卵巢切除法更早出現(xiàn)原發(fā)性KOA軟骨損傷，造模效率更高。

2 非手術(shù)方法

2.1關(guān)節(jié)制動(dòng) 膝關(guān)節(jié)長(zhǎng)期制動(dòng)可導(dǎo)致骨骼肌萎縮、韌帶結(jié)構(gòu)紊亂、半月板血供不足、關(guān)節(jié)內(nèi)壓力改變等變化，最終可出現(xiàn)與臨床近似的膝關(guān)節(jié)退行性改變。錢(qián)潔等[15]通過(guò)用石膏伸直位固定大鼠從踝到髖關(guān)節(jié)，制動(dòng)后3周即有膝軟骨表層細(xì)胞凋亡、蛋白多糖和Ⅱ型膠原減少等早期退變特征，實(shí)驗(yàn)6周為中期KOA樣改變，實(shí)驗(yàn)8周為晚期KOA樣改變。

2.2寒冷刺激 寒冷刺激法造模時(shí)間較短，且操作簡(jiǎn)單，造模效率高，是研究KOA的發(fā)病機(jī)制的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，林強(qiáng)等[16]采用寒冷刺激聯(lián)合石膏固定的方法，將大鼠肢體于(4.0±0.8)℃水中處理4 h，然后在石膏伸直位固定4 h，連續(xù)6周后血清和滑膜組織中炎性細(xì)胞因子水平及關(guān)節(jié)軟骨中ADAMTs-4、ADAMTs-5蛋白表達(dá)測(cè)定有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，成功建立大鼠KOA模型。

2.3關(guān)節(jié)撞擊 MROSEK等[17]認(rèn)為快速的高強(qiáng)度撞擊刺激能夠穿透關(guān)節(jié)軟骨作用于軟骨下骨，因而誘發(fā)KOA樣改變，他們采用“落塔”微重力裝置撞擊成熟犬髕骨關(guān)節(jié),6個(gè)月后組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，刺激區(qū)軟骨基質(zhì)符合早期KOA病理改變。

2.4關(guān)節(jié)腔注射藥物

2.4.1尿激酶型纖溶酶原激活物 石輝等[18]將尿激酶型纖溶酶原激活物注入兔膝關(guān)節(jié)腔，造成膝關(guān)節(jié)軟骨退變,且退變程度隨著時(shí)間增加逐漸加重，12周后可造模成功，此模型可為研究KOA的病因、病理改變、發(fā)病機(jī)理及探尋治療手段提供良好的實(shí)驗(yàn)工具。

2.4.2木瓜蛋白酶 汪宗保等[19]將木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合注射大鼠膝關(guān)節(jié)腔誘導(dǎo)建立大鼠KOA模型，通過(guò)環(huán)境掃描電鏡發(fā)現(xiàn)注射4～6周可建立大鼠早期KOA模型，同時(shí)證明采用掃描電鏡能壓縮標(biāo)本觀測(cè)時(shí)間，比大體觀察更早發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎的變化。

2.4.3膠原蛋白酶 黃永明等[20]將Ⅱ型膠原蛋白酶注入SD大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，7 d后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)組織有早期KOA樣改變，成功建立大鼠早期KOA模型，同時(shí)發(fā)現(xiàn)大鼠體質(zhì)量、膝關(guān)節(jié)直徑、組織病理、胸腺及脾臟重量和臟器系數(shù)等指標(biāo)可為藥物治療KOA療效和安全性評(píng)價(jià)、作用機(jī)制等方面的研究提供參考。

2.4.4碘乙酸鹽 許世兵等[21]將碘乙酸鹽注射到SD大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，2周后影像學(xué)和組織病理觀察發(fā)現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)股骨下端和脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)面失平整，關(guān)節(jié)變形和關(guān)節(jié)軟骨缺損，軟骨細(xì)胞排列紊亂，股骨和脛骨端骨小梁面積顯著減少，骨髓腔細(xì)胞增生等現(xiàn)象，成功建立大鼠KOA模型。另外，此研究采用活體成像技術(shù)可快速獲取影像資料、動(dòng)態(tài)跟蹤觀察，避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物損耗，實(shí)現(xiàn)同一個(gè)動(dòng)物模型的動(dòng)態(tài)觀察。

其他物質(zhì)如透明質(zhì)酸酶、聚乙烯亞胺、雌二醇、腎上腺皮質(zhì)激素、菲律賓菌素、軟骨碎片或者異物等注入動(dòng)物膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)也可致膝關(guān)節(jié)軟骨退變，建立KOA動(dòng)物模型[22]。

3 自發(fā)動(dòng)物模型

3.1自發(fā)動(dòng)物模型優(yōu)點(diǎn) 自發(fā)KOA動(dòng)物模型可避免其他方式造模操作誤差等帶來(lái)的影響,是研究KOA發(fā)病機(jī)制、膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨生化改變及KOA防治效果比較等方面的理想模型。

3.2自然自發(fā)模型 研究者發(fā)現(xiàn)C57黑鼠可天然自發(fā)形成骨關(guān)節(jié)炎[23]，在C57黑鼠自發(fā)的基礎(chǔ)上增加運(yùn)動(dòng)以增加關(guān)節(jié)負(fù)荷，C57 黑鼠KOA自發(fā)率顯著增加[24]。MURAOKA 等[25]研究發(fā)現(xiàn)12個(gè)月齡的雄性 Hartley 豚鼠膝關(guān)節(jié)，可觀察到表層軟骨細(xì)胞丟失，糖胺聚糖異常分布，膠原溶解、斷裂和排列紊亂等退變特征，與人類(lèi)KOA病理改變相似。但自然自發(fā)模型造模時(shí)間較長(zhǎng)，限制了其在研究中的應(yīng)用。

3.3轉(zhuǎn)基因模型 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，使轉(zhuǎn)基因KOA動(dòng)物模型成為可能。通過(guò)基因工程技術(shù)敲除調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因可使軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡，模擬KOA的病理過(guò)程[26]。RODRIGUEZ等[27]研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠Col11a1基因，可導(dǎo)致Ⅺ型膠原不能合成正常的膠原纖維，使小鼠表現(xiàn)出KOA樣的病理特征。HYTTINEN等[28]研究發(fā)現(xiàn)Col2a1等位基因與軟骨內(nèi)骨形成有相關(guān)性，失活其等位基因可導(dǎo)致軟骨形成障礙，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨軟化。于斐等[29]采用敲除15個(gè)月齡小鼠沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)的基礎(chǔ)上腹腔注射Tamoxifen并切斷單側(cè)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶和切除內(nèi)側(cè)半月板誘導(dǎo)建立膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，此KOA模型膝關(guān)節(jié)的退變與老年人KOA的發(fā)生過(guò)程相似。轉(zhuǎn)基因KOA動(dòng)物模型，由于造模成本高，與人類(lèi)KOA的發(fā)病機(jī)制是否一致等問(wèn)題，使得該類(lèi)模型在KOA發(fā)病機(jī)制、防治等方面的研究較少采用。

4 展 望

建立動(dòng)物模型來(lái)探討KOA發(fā)病機(jī)理和尋求安全有效的治療手段成為研究KOA的重要方法。造模方法很多，但每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，手術(shù)途徑制作的模型，操作較復(fù)雜，創(chuàng)傷較大，但誘導(dǎo)成功率高，穩(wěn)定性好；關(guān)節(jié)內(nèi)注造模，造模時(shí)間短，受其他因素干預(yù)少，主要適用于軟骨病變及藥物防治的研究，但注射模型誘發(fā)的軟骨基質(zhì)分解代謝強(qiáng)烈，病程及組織病理學(xué)變化與關(guān)節(jié)不穩(wěn)所導(dǎo)致KOA差異較大。自發(fā)模型和轉(zhuǎn)基因模型收到外界干擾較少，能夠避免造模操作的誤差對(duì)研究的影響，是研究KOA發(fā)病機(jī)制等方面理想的模型，但自發(fā)造模時(shí)間較長(zhǎng)的缺點(diǎn)限制了其在研究中的使用。轉(zhuǎn)基因模型因造模成本高，其誘發(fā)機(jī)制和人類(lèi)的發(fā)病機(jī)制的相似性還有待確定，使得轉(zhuǎn)基因模型較少被采用?，F(xiàn)階段的研究還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一種較完美的動(dòng)物模型，因此研究者需要根據(jù)研究的需要，結(jié)合各種KOA動(dòng)物模型的特點(diǎn)，選擇適合的動(dòng)物模型。

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