柞蠶核型多角體病主要防治技術(shù)概述＊

呂 銀，程 明，柯皓天，劉 玲，陳祥平，范小敏

（1.四川省絲綢科學(xué)研究院，四川 成都 610031；2.四川省絲綢工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610031；3.四川省絲綢協(xié)會，四川 成都 610031）

柞蠶（Antheraea pernyi）屬昆蟲綱、鱗翅目、大蠶蛾科、柞蠶屬的吐絲昆蟲，我國柞蠶、柞樹資源豐富，柞蠶鮮繭產(chǎn)量約占全世界總產(chǎn)量的90%以上，經(jīng)濟(jì)價值大。柞蠶核型多角體病又稱柞蠶膿病，是柞蠶生產(chǎn)的主要病害之一，由于各地發(fā)病時期和癥狀不盡相同，也稱嫩起子、水眠子、半蛻皮、老虎蠶、黃爛皮、油爛繭以及里倒山等。該病發(fā)生廣泛，我國遼寧、吉林、黑龍江、河南、山東、四川等柞蠶產(chǎn)區(qū)及國外飼養(yǎng)柞蠶區(qū)都有發(fā)生，一般年份的發(fā)病在10%左右，嚴(yán)重時達(dá)50%以上，危害嚴(yán)重。一直來對柞蠶核型多角體病主要從改善放養(yǎng)環(huán)境和養(yǎng)蠶技術(shù)上加以防治，上世紀(jì)60年代后，科技工作者開始從傳染途徑、發(fā)病機(jī)理和消毒措施等方面進(jìn)行綜合防治研究。

李光澤等研究ApNPV感染潛隱期，發(fā)現(xiàn)蟻蠶感染多角體病毒，主要在1齡、2齡發(fā)病；蟻蠶食下經(jīng)藥劑或自然致弱的多角體病毒后，潛伏期顯著延長，到4齡、5齡開始發(fā)?。粚⒂坞x病毒接種蛹體，病毒增殖可分四個時期：減少期、潛隱期、高速增殖期和平穩(wěn)期，25℃下潛隱期為8 d，但經(jīng)0.5%福爾馬林致弱處理，其潛隱期延長為17 d。

李光澤等研究柞蠶消化液對多角體病毒的滅活作用，發(fā)現(xiàn)柞蠶消化液是ApNPV感染的主要防御物質(zhì)，游離態(tài)病毒在消化液中10 min便失去活性，多角體病毒在消化液中120 min失去活性，其消化液的滅活力隨柞蠶齡期的增進(jìn)而逐漸提高；柞蠶經(jīng)0～5℃低溫處理48 h后，消化液對病毒的滅活力明顯降低，如處理后移至常溫下，則消化液的滅活力逐漸恢復(fù)，24 h后基本恢復(fù)；起蠶經(jīng)40℃以上高溫處理4 h，消化液的滅活力也顯著降低，盛食期影響較?。恍Q大量喝水也能降低消化液對病毒的滅活力；消化液中某種物質(zhì)對病毒的滅活起主要作用，消化液離體于60℃以上高溫下處理1 h則這種物質(zhì)完全失去活性，于室溫下放置24 h則其活性明顯降低，但低溫（-35℃）處理對其活性影響不大。柞蠶核型多角體病的傳染途徑主要為經(jīng)口食下傳染和體壁創(chuàng)傷染，切斷其傳染途徑是預(yù)防該病發(fā)生的關(guān)鍵。給柞蠶體接種福爾馬林死毒疫苗，因?yàn)樽跣Q體本身沒有完整有免疫系統(tǒng)，其保護(hù)指數(shù)在0.5以下，此防治技術(shù)無應(yīng)用價值；先后篩選上百種抗病毒藥劑，僅有肽丁胺等少數(shù)幾種有一定的治療效果，但治愈率只有30%左右，所以藥物治療也不實(shí)用；根據(jù)病原特性及傳染機(jī)制，采用消毒防病的措施，取得了很好防治效果。

隨著新技術(shù)和抗病品種的推廣應(yīng)用，柞蠶核型多角體病的發(fā)病率基本控制在10%以下，但近幾年來，四川蠶區(qū)柞蠶核型多角體病又出現(xiàn)起伏，甚至有上升的趨勢。

1 柞蠶核型多角體病毒特征及傳染途徑

柞蠶核型多角體病的病原為桿狀病毒科（Baculovirudae）、核型多角體病毒屬（Alphabaculovirus）的柞蠶核型多角體病毒（Antheraea pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus，ApNPV）。ApNPV有兩種存在形式，一種是多角體病毒，病毒粒子包埋在多角體中，另一種是游離態(tài)病毒，沒有多角體包被的裸露病毒。

1.1 多角體病毒

多角體在光學(xué)顯微鏡下呈三角形、四角形或不規(guī)則形，具有較強(qiáng)的折光性和淡青色熒光；在電子顯微鏡下大多呈為三角形四面體、四角形六面體及不規(guī)則體。多角體的蛋白晶格具有高度規(guī)則性，排列均一、整齊。多角體大小因宿主齡期和組織的不同存在差異，在0.7 μm～10 μm間。1～2齡蠶體內(nèi)形成的多角體較小，4～5齡蠶體內(nèi)形成的多角體較大。同一組織不同細(xì)胞內(nèi)形成的多角體大小也存在差異，但同一細(xì)胞內(nèi)多角體的大小基本一致，一個細(xì)胞內(nèi)多角體數(shù)量越多則多角體就越小，反之亦然。成熟多角體的表面多光滑致密，不成熟多角體的表面多凹凸不平，處在裂解期多角體的表面呈縱橫飾紋或瓦棱狀。多角體本身不具備致病能力，但包埋內(nèi)的病毒可借助其保護(hù)而長時間保持致病能力。

1.2 游離態(tài)病毒

游離態(tài)病毒體積小，只有在電子顯微鏡下才能看到，所以游離態(tài)病毒能通過細(xì)菌濾過器，因此也稱濾過性病毒。ApNPV粒子多呈桿狀，大小約為55 μm×350 μm，紫外檢測屬典型的昆蟲桿狀病毒。成熟的ApNPV粒子被雙層膜包裹，發(fā)育膜在最外層，內(nèi)膜為緊貼病毒體和發(fā)育膜的一層薄膜，封堵在多角體內(nèi)的的ApNPV粒子常常形成整齊排列的病毒束。自然狀態(tài)下病毒粒子可經(jīng)口或通過體壁創(chuàng)傷口引起感染，ApNPV感染組織細(xì)胞時，便釋放出核酸而留下外殼，核酸為雙鏈環(huán)狀脫氧核糖核酸，約130 kb，可復(fù)制、增殖，具有感染性，蛋白質(zhì)外殼不具有致病能力。病毒粒子的其中一端有一個吸附裝置的突起，在病毒侵染時發(fā)揮作用。當(dāng)柞蠶感染ApNPV后，在細(xì)胞核內(nèi)形成一種特異的產(chǎn)物即多角體，在多角體內(nèi)包埋許多具有致病能力的病毒粒子。

1.3 傳染途徑

柞蠶核型多角體病是一種急性傳染病，多角體病毒和游離病毒都能經(jīng)食下傳染和創(chuàng)傷傳染引起該病的發(fā)生，而游離病毒只能經(jīng)創(chuàng)傷傳染引起該病的發(fā)生。ApNPV附著在柞蠶卵面或新鮮柞葉上，隨蟻蠶孵化或者幼蟲食葉而進(jìn)入蠶中腸，堿性消化液將多角體溶解后釋放出病毒粒子；一部分病毒粒子脫去囊膜和核衣殼后進(jìn)入中腸細(xì)胞，核酸在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，但只有少數(shù)會形成多角體態(tài)病毒，另外部分病毒粒子進(jìn)入體腔后隨血液循環(huán)而侵入脂肪體、血細(xì)胞、氣管上皮細(xì)胞、體壁真皮細(xì)胞等，在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制、增殖，形成多角體；隨著不斷的增值，細(xì)胞核也不斷變大，直到整個細(xì)胞核充滿了多角體，細(xì)胞核乃至整個細(xì)胞被多角體撐破；以上就是食下傳染，是該病的主要傳染途徑。此外，因在收蟻和養(yǎng)蠶過程中的勻蠶、移蠶等操作不當(dāng)，造成幼蟲體壁創(chuàng)傷，也能引起游離病毒的創(chuàng)傷傳染而發(fā)病。

王林美等研究ApNPV對柞蠶蛹卵巢細(xì)胞的感染性，發(fā)現(xiàn)在倒置顯微鏡下，柞蠶蛹卵巢細(xì)胞被Ap-NPV感染5 d后，細(xì)胞內(nèi)開始有多角體病毒出現(xiàn)，細(xì)胞開始變得脹大，被感染7 d后，多角體數(shù)量顯著增多，此時培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中檢測到包涵體病毒效價濃度為6.95×105TCID50/mL；在電子顯微鏡下，細(xì)胞早期的表現(xiàn)為細(xì)胞核逐漸膨大，隨后在細(xì)胞核內(nèi)檢測到核衣殼和病毒發(fā)生基質(zhì)，然后形成病毒束，成為成熟的病毒粒子，一個多角體中包埋有多個病毒粒子，多角體具有強(qiáng)折光性，直徑在0.7 μm～10 μm；ApNPV對柞蠶蛹卵巢細(xì)胞敏感度較高，為典型的桿狀病毒復(fù)制。

2 柞蠶核型多角體病的發(fā)病癥狀

柞蠶核型多角體病主要發(fā)生在蠶期和蛹期，其典型癥狀是：蠶體腫脹，體皮變色并質(zhì)脆易破，化膿腐爛。由于蠶的發(fā)育時期不同，病蠶表現(xiàn)出來的癥狀也有明顯差異。

2.1 幼蟲期病癥

柞蠶核型多角體病在1齡期發(fā)病較少，多發(fā)生在2齡、3齡眠中或眠起時，俗稱“水眠子”，表現(xiàn)為病蠶體壁柔軟、體節(jié)腫脹、體色變黃、體腔內(nèi)血淋巴增多，通常用腹足及尾足抱住柞樹枝條，頭部下垂，隨著病勢發(fā)展，體壁逐漸潰爛，流膿而死。指蠶染病后，在眠起蛻皮時舊皮脫下一部分，有的僅蛻下一半舊表皮，呈半蛻皮蠶，多倒掛于柞樹枝葉而死，表現(xiàn)為“半蛻皮”?！澳燮鹱印敝覆⌒Q眠起蛻皮后，體壁柔軟不硬化，體色暗淡，體節(jié)腫脹，有時尾部的三角板變成黑褐色，隨著病情發(fā)展，體壁逐漸破裂，流膿而死?！包S爛皮”多發(fā)生在3～5齡，病蠶初期體色變淡，皮下、脂肪體等組織開始潰爛，混濁呈豆腐腦狀，隨著病勢加重，體壁逐漸破裂、流膿而死?！袄匣⑿Q”多發(fā)生在5齡盛食期至營繭前，病蠶初期體節(jié)腫脹，背部疣狀突起和氣門線下疣狀突起部位可見褐色、灰色的小斑點(diǎn)，由小變大，形成黑褐色病斑，形如虎皮斑紋，故稱老虎蠶，隨著病勢加重，病斑處逐漸破裂，流膿而死?！坝蜖€繭”指一部分患病較輕的蠶可吐絲結(jié)繭，有的蠶只吐出一部分絲，死于繭殼內(nèi)，尸體逐漸潰爛，流出膿汁污染繭殼呈黑褐色，也稱“里倒山”。

2.2 蛹期病癥

柞蠶在4齡、5齡感染ApNPV，可能延遲至蛹期發(fā)病，病蛹癥狀為：體色渾暗，蛹皮脆弱，顱頂板變成黑灰色或灰褐色，稍經(jīng)觸動即破裂而流出膿汁，流出的膿汁浸透繭殼，成為油爛繭狀。有的病蛹、膿汁在繭殼內(nèi)慢慢陰干，整個繭變得很輕，而稱為“空瓤繭”。

3 防治措施

柞蠶核型多角體病屬強(qiáng)烈的傳染性疾病，必須從阻斷傳染途徑、增強(qiáng)蠶抵抗力以及改善放養(yǎng)條件等多方面綜合施策，才能取得良好的防治效果。朱有敏等研究柞蠶對ApNPV感染的抵抗性與部分生命力性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)孵化率與稚蠶對ApNPV感染的抵抗力呈顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.71，而與5齡壯蠶對ApNPV感染的抵抗力及自然發(fā)病率相關(guān)關(guān)系不顯著；5齡壯蠶對ApNPV感染的抵抗性與5齡壯蠶感染ApNPV后的蟲蛹統(tǒng)一生命率相關(guān)系數(shù)為0.98，呈顯著正相關(guān)；柞蠶品種對ApNPV的抗性，應(yīng)依據(jù)稚蠶期和5齡壯蠶期2個發(fā)育階段對病毒感染的抵抗性來進(jìn)行綜合鑒定。

賈姝等分析ApNPV侵染對柞蠶幼蟲體內(nèi)部分保護(hù)酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)柞蠶幼蟲被ApNPV侵染后，其血淋巴中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性逐漸升高，分別在接種后第3天、第4天達(dá)到最大值，分別是573.97 U/（mL·min）、0.11 U/（mL·min），之后又逐漸下降；血淋巴中的過氧化氫酶（CAT）活性則表現(xiàn)出先降低后升高的變化趨勢，接種后第5天達(dá)到峰值378.44 U/（mL·min），之后又逐漸下降；在柞蠶對ApNPV的免疫防御過程中，POD、SOD首先作出應(yīng)答反應(yīng)，CAT其后作出應(yīng)答反應(yīng)，且試驗(yàn)組幼蟲血淋巴中的POD活性始終高于發(fā)育同期的對照組幼蟲，推測POD是起主要作用的保護(hù)酶。

3.1 消滅病毒，切斷傳染途徑

柞蠶核型多角體病發(fā)生的主要原因?yàn)椴《靖腥?，其中卵面感染?齡、2齡小蠶期感染最為重要。因此，嚴(yán)格消毒，徹底消滅病毒，是預(yù)防該病發(fā)生的關(guān)鍵。蠶室、蠶具用3%甲醛溶液噴霧消毒或毒消散（5 g/m3）熏蒸消毒，密封24 h后通風(fēng)，周圍環(huán)境及走廊通道用5%石灰水噴灑或生石灰粉消毒。蠶具也可單獨(dú)用石灰水浸泡或用甲醛與高錳酸鉀作用產(chǎn)生的氣體消毒。卵面消毒在春季一般先用0.5%～0.8%氫氧化鈉洗卵1 min，然后再用10%鹽酸浸卵10 min，或者用3%甲醛（鹽酸甲醛混合液）浸泡30 min（24±1℃）；在秋季直接用3%甲醛（鹽酸甲醛混合液）浸泡30 min（24±1℃），或用甲醛與高錳酸鉀（100 mL：60 g）混合產(chǎn)生的甲醛氣體消毒60 min；為了防止卵面消毒后的再感染，消毒后的蠶卵應(yīng)及時送到山上蠶場或保存在無毒保卵室內(nèi)陰干，進(jìn)入保卵室的人員要防止帶入病毒，沒有條件建立保卵室的，可直接放入保卵盒，或放在無污染、未堆過繭、未制過種的潔凈房屋保卵。

3.2 及時收蟻，防治抓傷傳染

小蠶相互抓傷而發(fā)生創(chuàng)傷傳染是柞蠶核型多角體病發(fā)生的主要原因之一。春蠶期多在室內(nèi)暖卵，一般黎明時孵化，很難做到及時收蟻。為了改變這種狀況，可以在孵化前一天晚上，將卵拿至室外，24 h左右再拿回室內(nèi)，這樣孵化時間將推遲到早上7時左右，邊出蠶邊收蟻，可以避免小蠶成堆，互相抓傷，每天重復(fù)，直至全部孵化。秋蠶期孵化時溫度較高，更要掌握好孵化時間，同時嚴(yán)格消毒，按時收蟻，及時上山。

3.3 加強(qiáng)養(yǎng)蠶管理，防止蠶期擴(kuò)大傳染

科學(xué)養(yǎng)蠶，及時勻蠶、移蠶，使蠶良葉飽食。選用上年未發(fā)病或發(fā)病較輕的柞園飼養(yǎng)春蠶。蠶期嚴(yán)禁摟草，防止塵土污染，避免雨天、大霧天或中午溫度較高時移蠶，小蠶期抵抗外界惡劣環(huán)境能力較差，可采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施。發(fā)現(xiàn)病蠶及時淘汰，集中深埋或燒毀；防止病蠶污染柞葉、蠶具、人體以擴(kuò)大傳染。夏季應(yīng)避免雨天摘繭，需適時摘繭、隨摘隨剝、及時穿掛，避免種繭堆放，發(fā)現(xiàn)油爛繭及時挑出并銷毀或深埋。應(yīng)加強(qiáng)種繭、種卵保護(hù)，保持適當(dāng)?shù)臏貪穸取?/p>

3.4 推廣抗病品種及雜交種

提高柞蠶對核型多角體病毒的抵抗能力以及選育高抗品種，是防治柞蠶核型多角體病的有效措施之一。選擇抗病性強(qiáng)和上代放養(yǎng)精細(xì)、發(fā)育健壯、發(fā)病較輕的蠶種進(jìn)行放養(yǎng)，生產(chǎn)上推廣應(yīng)用抗病品種和雜交種，可一定程度減少發(fā)病，提高產(chǎn)量、增加收益。

4 柞蠶核型多角體病的分子生物學(xué)研究

柞蠶屬野外放養(yǎng)的泌絲昆蟲，具有蛹體較大、以蛹越冬、方便保存、容易固定、保存時間長且便于運(yùn)輸?shù)忍匦?。利用柞蠶蛹作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)功能性蛋白質(zhì)，既能大規(guī)模機(jī)械化生產(chǎn)，又能有效降低勞動強(qiáng)度以及減少操作上的煩瑣。黃元姣等用ApNPV載體表達(dá)系統(tǒng)，將BO半乳糖苷酶基因（LacZ）在柞蠶培養(yǎng)細(xì)胞（AnPe細(xì)胞）中實(shí)現(xiàn)成功表達(dá)，同時通過進(jìn)行篩選、純化，獲得了AnpeLacZ重組病毒。賈平驁等利用BLAST軟件在線檢索ApNPV特異基因ORF142的序列后，設(shè)計了引物AP1，對ApNPV基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，獲得大約130 bp的DNA片段，其病毒DNA最低檢測濃度為0.5 fg/mL，用該方法檢測ApNPV快速而方便，且添毒濃度與感染后的檢出時間呈正相關(guān)。

病毒microRNAs（VmiRNA）是病毒基因組編碼的一種小RNA分子，在病毒侵染宿主以及病毒繁殖過程中發(fā)揮作用。李文利等采用現(xiàn)代分子測序技術(shù)檢測柞蠶被ApNPV感染后的病毒microRNAs含量變化，并用計算機(jī)分析技術(shù)預(yù)測ApNPV基因編碼的VmiRNA前體序列，結(jié)果從被ApNPV感染的柞蠶蛹脂肪體中擴(kuò)增出13條預(yù)測前體序列，且在病毒基因組中可以找到10條同源序列；利用熒光定量PCR技術(shù)證明有9條同源序列能夠擴(kuò)增出相應(yīng)大小的基因片段，初步確認(rèn)這是由病毒基因組編碼的VmiRNA成熟序列；利用靶基因在線預(yù)測程序RNAhybrid預(yù)測，獲得這些VmiRNA作用的135個可能的靶向基因，其中36個基因與免疫應(yīng)答過程相關(guān)，19個基因與免疫系統(tǒng)進(jìn)程相關(guān)，8個基因與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，9個基因與免疫系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)，推測這些VmiRNA在病毒與宿主的相互作用中發(fā)揮著重要作用。

為探究ApNPV載體表達(dá)系統(tǒng)是否可用于表達(dá)哺乳動物活性蛋白，葉博等利用該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)醫(yī)用蛋白人生長激素（hGH），發(fā)現(xiàn)柞蠶蛹感染重組病毒后7 d，體液中明顯檢測到hGH表達(dá)；之后hGH含量保持較高水平，重組hGH的最高表達(dá)量達(dá)到251.18 μg/mL；第15～20 d仍可檢測到hGH表達(dá)，但表達(dá)產(chǎn)物開始降解；利用活化的人白血病細(xì)胞K562檢測經(jīng)ApNPV載體表達(dá)系統(tǒng)在蠶蛹內(nèi)表達(dá)的重組hGH的體外活性，顯示重組hGH對細(xì)胞K562的增殖具有顯著的促進(jìn)作用。為了探索ApNPV內(nèi)源性非編碼小RNA成熟體MD5對宿主靶基因的功能，宋麗新等利用現(xiàn)代生物信息學(xué)以及Solexa高通量測序技術(shù)，從ApNPV基因組中篩選、分離出成熟的MD5，通過GO數(shù)據(jù)庫分析MD5對靶基因的功能，發(fā)現(xiàn)MD5調(diào)控的宿主靶基因在細(xì)胞內(nèi)的分子結(jié)合、免疫反應(yīng)以及酶催化中發(fā)揮作用，其中有4個靶基因與柞蠶免疫應(yīng)答相關(guān)；熒光定量PCR檢測MD5在脂肪體內(nèi)表達(dá)上調(diào)，推測VmiRNA MD5在宿主柞蠶免疫相關(guān)基因的表達(dá)過程中扮演著重要角色。